原核生物的转录调控

关于原核生物的转录调控第一页，共八十五页，2022年，8月28日转录的两个基本问题：1、蛋白质如何识别DNA的结合位点？2、转录的抑制或增强是如何进行的？第二页，共八十五页，2022年，8月28日基因表达与转录调控第三页，共八十五页，2022年，8月28日重要的概念1、反式作用因子和顺式作用元件2、结构基因和调控基因3、正调控和负调控4、单顺反子和多顺反子5、异构调控第四页，共八十五页，2022年，8月28日反式作用因子和顺式作用元件基因的转录活性主要通过反式作用因子（trans-actingfactor）和顺式作用元件（cis-actingelement）之间的特异相互作用来调节。反式作用因子为蛋白质。例如：RNA聚合酶顺式作用元件为DNA。例如：启动子和终止子第五页，共八十五页，2022年，8月28日反式作用和顺式作用的概念反式作用顺式作用第六页，共八十五页，2022年，8月28日结构基因和调控基因结构基因（structuralgene）：编码RNA或蛋白质（包括结构蛋白、酶和调控蛋白）的基因；调控基因（regulatorgene）:编码调控蛋白（regulatorprotein）的基因，参与调控一个或多个结构基因表达。调控蛋白通过结合在DNA的特定位点以调控其转录。

靶基因位点第七页，共八十五页，2022年，8月28日调控蛋白激活蛋白（activator）：增强转录阻遏蛋白（repressor）：抑制转录操纵基因，调控蛋白的结合位点第八页，共八十五页，2022年，8月28日9调控蛋白缺失:基底转录负调控（negativeregulation）：阻遏蛋白结合DNA抑制基因表达正调控（positiveregulation）：激活蛋白结合DNA增强基因表达正调控和负调控第九页，共八十五页，2022年，8月28日单顺反子（monocistonicmessage）和多顺反子（polycistonicmessage）第十页，共八十五页，2022年，8月28日异构调控（allostery

regulation)许多调控蛋白都是变构蛋白(allostericprotein)，通过与效应物结合改变构象而改变活性，起到调节基因转录表达的作用，即异构调控第十一页，共八十五页，2022年，8月28日细菌基因表达调控策略：将功能相关的基因集合成组，这样易于整体调控。&相互临近、协同调控的一组基因的被称为操纵子（operon）。如：lac操纵子&非临近但协同调控的一组基因的被称为调节子如：mal调节子第十二页，共八十五页，2022年，8月28日操纵子与乳糖操纵子1.提出：1961年,Jacob

（雅格布）-Monod（莫诺）.2.操纵子(operon)：操纵子是原核生物基因表达和调控的单元，典型的操纵子包括：结构基因、调控元件和调节基因。大肠杆菌K12中共有4136个基因，以操纵子结构存在的基因接近1/4（256操纵子，控制879基因）第十三页，共八十五页，2022年，8月28日操纵子结构结构基因：控制某一代谢途径关键酶的多顺反子。调控元件：启动子和操纵区（覆盖在启动子和编码区交叉区，是阻遏调节蛋白质的结合位点）。调节基因：独立编码蛋白质的基因。

调节基因的产物结合调控元件，抑制或激活结构基因的表达。第十四页，共八十五页，2022年，8月28日乳糖操纵子ThelacZ,lacY,lacAgenesaretranscribedintoasinglelacZYAmRNA(多顺反子)underthecontrolofasinglepromoterPlac

.操纵基因，又称操作子(operator)，为顺式调控元件，不编码任何产物！第十五页，共八十五页，2022年，8月28日细菌生长特点环境变化营养供给能量消耗最低化

当某种物质不存在时，细菌就不合成该物质代谢途径中的酶；而当该物质出现时，立即合成所需的代谢酶。这种当特定底物出现才合成特定酶的过程称为诱导（induction）。细菌能够快速做出应答，迅速从利用一种物质转变为另一种物质第十六页，共八十五页，2022年，8月28日双峰生长(diauxicgrowth)E.coli

生长在含有葡萄糖（glucose）和乳糖（lactose）的培养基上。细胞首先利用葡萄糖快速生长，直至葡萄糖耗尽。随后，细胞停止生长，“调整”以适应新的营养源——乳糖。延滞期：约1小时开启lac操纵子，积累乳糖代谢所需要的酶第十七页，共八十五页，2022年，8月28日在正常情况下，E.coli是以葡萄糖作为碳源的，葡萄糖是单糖，E.coli利用它最为方便和经济。在没有葡萄糖，只有乳糖存在的条件下，E.coli也能以乳糖为碳源而生存。

乳糖是双糖，是葡萄糖和半乳糖的复合物。以乳糖为碳源必须先将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖，再将半乳糖转化为葡萄糖，这就需要额外的酶。

结果解读第十八页，共八十五页，2022年，8月28日细菌开始乳糖代谢所需要的酶1、将乳糖转运至细胞内β-半乳糖通透酶2、乳糖代谢：分解乳糖（二糖）分解为单糖b-半乳糖苷酶3、β-半乳糖苷乙酰转移酶，作用不明。在有葡萄糖存在时，细菌体内的这三种酶含量很低。每个细胞中只有3－5个分子的β—半乳糖昔酶。当培养基中没有葡萄糖而有乳糖存在时，这三种酶的量急剧增加，2－3分钟内即可增加1000倍以上，而且三种酶成比例增加。一旦乳糖用完，在2－3分钟内这三种酶的量又很快下降到本底水平。第十九页，共八十五页，2022年，8月28日启动子PlaclacZlacAlaclOlaclacY调控元件结构基因

β-半乳糖通透酶β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷乙酰转移酶

调节基因操纵基因转录方向转录单元lacZYAPlacI启动子第二十页，共八十五页，2022年，8月28日lacZ乳糖/半乳糖苷半乳糖葡萄糖b-半乳糖苷键b-半乳糖苷酶异乳糖b-半乳糖苷酶催化侧链反应使乳糖重排，形成异乳糖（诱导物）第二十一页，共八十五页，2022年，8月28日lacYlacA第二十二页，共八十五页，2022年，8月28日第二十三页，共八十五页，2022年，8月28日启动子PlaclacZlacAlaclOlaclacY调控元件结构基因

β-半乳糖通透酶分解乳糖半乳糖和葡萄糖运送乳糖透过细胞壁乙酰辅酶A乙酰半乳糖β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷乙酰转移酶

乳糖转化异乳糖调节基因操纵基因转录方向转录单元lacZYAPlacI启动子阻遏蛋白lacI（Lacrepressor）第二十四页，共八十五页，2022年，8月28日1、LacI可以结合DNA，其结合位点为operator（O）;作用机制：LacI结合O位点，从而抑制RNA聚合酶和LacZYA基因启动子（PLac）的结合，从而阻止LacZYAmRNA的生成；2、LacI可以结合诱导物半乳糖，构象发生改变，不能结合operator,从而对Lac操纵子的抑制消失。第二十五页，共八十五页，2022年，8月28日阻遏蛋白lacI单体具有DNA结合域（Helix-turn-helix，1-59位氨基酸）和诱导物结合域。阻遏蛋白lacI单体寡聚化N’末端C’末端诱导物结合位点第二十六页，共八十五页，2022年，8月28日阻遏蛋白lacI四聚体的组装诱导物结合部位阻遏蛋白lacI由四个相同的单体亚基组成。第二十七页，共八十五页，2022年，8月28日O1RNApolymerase:a2bb’s70第二十八页，共八十五页，2022年，8月28日TTGACATATAAT-35box-10boxs70的一般识别位点TTTACATATGTT-35box-10boxLac操纵子promoter:AAAdownup第二十九页，共八十五页，2022年，8月28日Lac操纵子的O1回文结构第三十页，共八十五页，2022年，8月28日InJacobandMonad’smodel,thelacoperoncontainedasingleoperator(O1).However,twoadditionaloperators(O2andO3)weresubsequentlydiscovered.Infact,therearethreeoperators,theclassicaloperatorO1（majoroperator,主操纵基因）,centeredatposition+11,thedownstreamauxiliaryoperator（辅助操纵基因）O2,centeredatposition+412,andupstreamauxiliaryoperatorO3,centeredat–82.CAPisapositiveregulatorofthelacoperon.第三十一页，共八十五页，2022年，8月28日四聚体LacI蛋白和DNA的结合1、四聚体LacI蛋白的两个单体通过DNA结合结构域与Lac操纵子的O1区（中心位于+11）紧密结合，结合位点为反向重复序列。2、另一个二聚体的DNA结合结构域与O2（中心位于+412bp处）或O3（中心位于-82bp处）疏松结合，将DNA拉成环状。第三十二页，共八十五页，2022年，8月28日第三十三页，共八十五页，2022年，8月28日阻遏蛋白lacI与DNA的结合是通过异构调控来调节的阻遏蛋白结合诱导物后构型的变化：1、阻遏物由两个二聚体组成四聚体；2、二聚体的两个DNA结合域可以同时插入DNA大沟的两个相邻连续转角；3、诱导物（异乳糖）结合，改变了DNA结合域和核心区之间的角度方向，使二聚体两个头部不能同时和DNA结合，从而降低和操纵基因的亲和力第三十四页，共八十五页，2022年，8月28日诱导物改变LacI在DNA上的分布，而不是产生游离阻遏蛋白：随机DNA序列和阻遏蛋白也具有亲和力，但比操纵基因和阻遏蛋白的亲和力低107倍诱导物和阻遏蛋白结合时，阻遏蛋白和操纵基因的亲和力下降，所有阻遏蛋白结合在DNA的随机序列上（并不形成游离蛋白质）除去诱导物后，阻遏蛋白恢复活性，从随机位点直接转移到操纵基因上阻遏蛋白总是与DNA结合在一起第三十五页，共八十五页，2022年，8月28日问题乳糖操纵子即使在阻遏蛋白的阻遏状态下，也有本底水平的基因表达（约为诱导时表达水平的0.1%左右），这是由于LacI与O也偶尔解离，使细胞中有极低水平的β-半乳糖苷酶及β-半乳糖通透酶生成。第三十六页，共八十五页，2022年，8月28日1、抑制子LacI——负调控2、葡萄糖——抑制Lac操纵子葡萄糖的存在可防止从培养基中吸收其它碳源。当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时，lac启动子表达受阻3、CAP-cAMP复合物——正调控Lac操纵子的调控因子第三十七页，共八十五页，2022年，8月28日异乳糖诱导物乳糖重排β-半乳糖苷酶透性酶转乙酰酶

RNA聚合酶LacI单体LacI四聚体lacI介导的lac操纵子基因表达的负调控机制第三十八页，共八十五页，2022年，8月28日PEP,磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸PEP提供磷酸基团，EnzymeI(E1)直接被PEP磷酸化，磷酸化的E1将它的磷酸基团转移到HPr（磷酸载体蛋白），磷酸化的HPr是所有酶II（IIAGlc,IIB,IIC,IID）的磷酸基团供体：磷酸基团从HPr转移到EIIAGlc,再到EIIB,最终到达连接了葡萄糖的EIIC（有时会带上一个额外的链EIID），使葡萄糖发生磷酸化。EIIAGlcEIIAGlcIIAGlc是葡萄糖专一的酶II，具有多种调节的相互作用。它影响腺苷酸环化酶、甘油激酶和非PTS通透酶（如：β-半乳糖通透酶）的活性磷酸转移酶系统（PhosphotransferaseSystem，PTS）：单糖转运系统第三十九页，共八十五页，2022年，8月28日葡萄糖抑制Lac操纵子的分子机制β-半乳糖通透酶葡萄糖对Lac操纵子的分解代谢阻遏(catabolicrepression)：IIAGlc由于葡萄糖转运而去磷酸化，导致其结合β-半乳糖通透酶，从而阻止乳糖进入细胞。第四十页，共八十五页，2022年，8月28日Lac操纵子的正调控因子功能：感知葡萄糖的缺乏，并通过激活lac

promoter，使RNA聚合酶结合并转录结构基因。lacoperon的正调控因子为一个复合体：cAMP结合其受体（cAMPreceptorprotein,CRP）。CRP又称为“降解代谢物激活蛋白”（cataboliteactivatorprotein,CAP）环化AMPcAMP-CAP复合物正调控的操纵子：lac,gal,ara等第四十一页，共八十五页，2022年，8月28日CAP对cAMP介导的b-半乳糖苷酶的激活至关重要

提取wild-type和mutant的细胞提取物，分别加入不同量的cAMP进行体外生产半乳糖苷酶；过多的cAMP间接抑制了半乳糖苷酶体外表达的某些步骤第四十二页，共八十五页，2022年，8月28日第四十三页，共八十五页，2022年，8月28日转录激活因子CAP

cAMP-CAP与DNA相结合，造成双螺旋弯曲，形成一个“环状”结构，lacI无法与O相结合，易于形成转录起始复合物，只要有这个“环”的亚基存在，lac

operon就可以得到表达。

cAMP-CAP还能直接和RNAPol相互作用，影响RNA聚合酶的活性。第四十四页，共八十五页，2022年，8月28日CAP-cAMP-DNAcomplex.Science2002第四十五页，共八十五页，2022年，8月28日Cell1994CAP第四十六页，共八十五页，2022年，8月28日cAMP/CAP的调控活性受ⅡAGlc蛋白的影响：ⅡAGlc蛋白的磷酸化形式可激活腺苷酸环化酶，当葡萄糖进入细胞时ⅡAGlc蛋白发生去磷酸化，导致腺苷酸环化酶活性降低。因此，当环境中无葡萄糖时，细胞内cAMP含量升高。腺苷酸环化酶第四十七页，共八十五页，2022年，8月28日有葡萄糖时，cAMP浓度降低，lac操纵子表达下降。由于Plac是弱启动子，只因乳糖的存在而发生去阻遏而使lac操纵子开放表达水平很低；有cAMP-CAP加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。cAMP-CAP对lac等操纵子具有强的正调控，能克服操纵子的代谢物阻遏效应。第四十八页，共八十五页，2022年，8月28日lac操纵子的强诱导条件：既要有乳糖又要无葡萄糖葡萄糖（+）；乳糖（-）：不诱导葡萄糖（+）；乳糖（+）：低诱导葡萄糖（-）；乳糖（+）：高诱导第四十九页，共八十五页，2022年，8月28日1、当lacI封闭转录时，CAP对Lac操纵子表达系统不能发挥作用；2、如无CAP加强转录，即使没有lacI与操纵序列结合，操纵子的转录活性很低。3、若有葡萄糖或葡萄糖和乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。葡萄糖对Lac操纵子的阻遏作用机制为分解代谢阻遏。4、

Lac操纵子的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖。第五十页，共八十五页，2022年，8月28日“来得快，去得快”——mRNA合成，对诱导反应迅速第五十一页，共八十五页，2022年，8月28日β-半乳糖苷酶稳定性很强第五十二页，共八十五页，2022年，8月28日操纵子的突变不可诱导型突变（uninduciblemutation）

使操纵子在任何情况下都不能表达组成型突变（consititutivemutation

）使操纵子不受调控物的影响而持续性表达。第五十三页，共八十五页，2022年，8月28日lacI基因突变导致操纵子持续性表达组成型突变突变的lacI基因产物不能结合DNA第五十四页，共八十五页，2022年，8月28日异乳糖诱导物乳糖重排β-半乳糖苷酶透性酶转乙酰酶

合成诱导物：IPTGRNA聚合酶第五十五页，共八十五页，2022年，8月28日一些乳糖类似物不能被β-半乳糖苷酶分解，却也能与LacI特异性结合而使其构象改变，诱导Lac操纵子的开放。如异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)是很强的非代谢性诱导剂，能够结合lacI，且性质稳定，不被细胞降解；X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）也是一种人工合成的半乳糖苷，可被β-半乳糖苷酶水解产生蓝色化合物，因此可以用作β-半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal被广泛应用在分子生物学和基因工程工作中。第五十六页，共八十五页，2022年，8月28日Lac操纵子的应用1、蓝白斑筛选2、IPTG体外诱导蛋白质表达第五十七页，共八十五页，2022年，8月28日

蓝白斑筛选原理：β-半乳糖苷酶可分成2部分即α肽段（N-端的146个aa）和C-段。α肽段的基因位于载体上并含有多克隆位点，而C-段的基因通过基因工程技术插入E.coli基因组。二者在同一菌株中表达时，菌株中的C-段与载体上的α肽段互补而具有酶活性，能将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。在MCS上插入新基因将会改变α肽段的ORF而使得载体上的α肽段不能与菌株中的C-段互补而不能切割无色化合物X-gal，从而产生白斑。选择转入的阳性克隆即选择白斑。

第五十八页，共八十五页，2022年，8月28日IPTG体外诱导蛋白质表达表达T7RNApolymerase溶原性噬菌体（如：DE3）在感染于寄主细菌时，不使细菌裂解，而成为与细胞同步增殖的遗传因子——前噬菌体。前噬菌体通常在寄主细菌细胞中的每个染色体上有1个，细菌分裂时前噬菌体也分裂并分配到两个子细胞中。

具有前噬菌体的细菌称为溶原性细菌。D第五十九页，共八十五页，2022年，8月28日原核表达宿主菌的选择BL21（DE3）：为λDE3溶原菌，其染色体上带有一拷贝由lacUV5启动子(不受cAMP-CAP调控)控制的T7RNA聚合酶基因。pLysS和

pLysE宿主菌带有编码T7溶菌酶（为T7

RNA聚合酶的天然抑制物）的pET相容性质粒。带有pLysS

的细胞产生少量溶菌酶，而pLysE宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制T7

RNA聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的pET重组体。Rosetta（DE3）：Rosetta宿主菌从BL21衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。这样Rosetta菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。第六十页，共八十五页，2022年，8月28日常用的表达载体pET系列pGEX系列第六十一页，共八十五页，2022年，8月28日第六十二页，共八十五页，2022年，8月28日第六十三页，共八十五页，2022年，8月28日阿拉伯糖操纵子（Thearaoperon）：参与阿拉伯糖代谢酶的基因分布于3个操纵子中：1、araBAD:编码3个阿拉伯糖代谢相关酶，1）核酮糖激酶(ribulokinase)、2）L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinoseisomerase)，3）L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(L-ribulose-5phosphate-4-epimerase)。2、araE

3、araFGH编码膜结合蛋白，参与阿拉伯糖的结合和转运第六十四页，共八十五页，2022年，8月28日核酮糖激酶L-阿拉伯糖异构酶L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶FEMSMicrobiolRev]](2010)1–18第六十五页，共八十五页，2022年，8月28日三个操纵子由一个调节基因（araC）的产物C蛋白调控：1、araC表达受到AraC的自我调控。2、araC既可充当阻遏物(不结合阿拉伯糖)，也可作为激活剂(结合阿拉伯糖)。3、araC与CAP可充分诱导ara操纵子。4、araC蛋白在阿拉伯糖操纵子上有3个不同结合部位:araI、araO1和araO2第六十六页，共八十五页，2022年，8月28日没有C蛋白时，转录CmRNA，表达一定水平的C蛋白负调控正调控cAMP-CAP结合了Ara的C二聚体araBAD和araC的起始转录需要cAMP-CAP，因此葡萄糖存在时araBAD和araC操纵子均关闭。

C蛋白二聚体当Ara存在而无葡萄糖时，Ara与AraC蛋白结合使其构象改变而释放araO2，不再成环，此时Ara-AraC结合在araI1，araI2和araO1处。同时由于cAMP的积累激活CAP，活化的CAP结合在位于araO1和araI间的CAP位点。araBAD表达，Ara-araC在araO1处结合使araC不能表达。即：araC+Ara和CAP共同作用可激活araBAD转录当cAMP水平较低且缺乏阿拉伯糖时，AraC二聚体结合在araO2和araI1半位点使DNA成环，阻遏araBAD的表达。第六十七页，共八十五页，2022年，8月28日当同时有葡萄糖和阿拉伯糖时，低水平的cAMP-CAP不能起始araBAD和araC转录，因此araBAD和araC都不表达。第六十八页，共八十五页，2022年，8月28日当AraC水平较低时，其基因从Pc开始表达。当AraC蛋白浓度高时，由于AraC与AraO1结合，而araO1与AraC基因的启动子重叠，可阻遏araC基因的表达。

AraC的自我调控第六十九页，共八十五页，2022年，8月28日色氨酸操纵子

(tryptophaneoperon,trpoperon)色氨酸的合成分5步完成。每个环节需要一种酶，编码这5种酶的基因为多顺反子，即trpE、trpGD（G和D基因融合）、trpCF（C和F基因融合）

、trpB、trpA。其中，E和G编码邻氨基苯甲酸合成酶；D编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶；F编码邻氨基苯甲酸异构酶、A和B编码色氨酸合成酶；C编码吲哚甘油-3-磷酶合成酶。色氨酸操纵子负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。由于trp体系参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖和cAMP-CAP的调控。

第七十页，共八十五页，2022年，8月28日色氨酸操纵子的结构

1、trpR和trpABCDE不紧密连锁，距离很远；

2、操纵基因（O）在启动子（P）内

3、有弱化子(attenuator)4、启动子和结构基因不直接相连，二者被前导序列(Leader)所隔开第七十一页，共八十五页，2022年，8月28日PO第七十二页，共八十五页，2022年，8月28日Thetrpoperon的调控阻遏调控色氨酸发挥co-repressor的作用阻遏调控抑制转录70倍弱化作用

翻译影响转录（只存在原核生物）弱化作用抑制转录10倍第七十三页，共八十五页，2022年，8月28日当色氨酸缺乏时，调节基因（trpR）编码无活性的为辅阻遏蛋白aporepressor当细胞中色氨酸浓度较高时，色氨酸和aporepressor结合，形成有活性的色氨酸操纵子阻遏蛋白aporepressor阻遏调控第七十四页，共八十五页，2022年，8月28日高Trp时：辅阻遏物蛋白+Trp