2014细胞生物学新技术简

细胞信号转导研究技术孙岳平细胞与分子生物学实验中心

2014.11FromUnicellularToMulticellularOrganism--细胞感受环境信号、把这种信号转导入细胞内，并做出反应的过程。细胞信号转导：

细胞外信号分子受体蛋白细胞内信号转导分子效应蛋白细胞反应细胞信号通路的基本组成信号转导通路的分子组成

主要由蛋白质组成：1.蛋白质往往具有酶活性：RTK、腺苷酸环化酶、磷脂酶C、磷酸激酶等，特异性和信号放大。2.蛋白质相互作用：结合域，特异性。3.蛋白质修饰：激活/失活、蛋白质相互作用第二信使（Secondmessenger)：在传递过程中产生的小分子：cAMP、cGMP、IP3、DG等，放大信号。

Signaltransductionininsulinaction这些不同的反应由不同的信号通路来介导Whensignalsgowrong….AbnormalsignalingcanhavedrasticanddramaticeffectsAchondroplasiaRetinoblastomaHumanbodyhas~75trillioncells

细胞对信号的反应:1.细胞质：蛋白质活性改变2.细胞核：基因表达改变-

转录出新的或更多的蛋白质ToKnowLife:FromMoleculeToCellGeneProteinBiologicalprocess由以下几个方面决定：合成速率：mRNA水平

稳定性：蛋白水平定位：细胞核、细胞质、细胞器活性：酶活性：激酶、NADPH氧化酶、组蛋白脱乙酰酶（HDAC）等转录活性：主要指转录因子(TF)，促进靶基因转录的活性注意：转录因子活性受到co-activator或co-repressor的调节和哪些蛋白在一起相互作用、相互影响？研究蛋白质在细胞内的活动情况需要从哪些方面入手？

研究实例（数据有所调整）

药物A可增强某种肿瘤细胞对化疗诱导凋亡的敏感性，欲研究药物A的作用机制。在某种生理或病理过程（如细胞分化、肿瘤发生、药物诱导）中，最初的有关基因表达变化的信息往往可以通过mRNA水平的变化（增高或降低）来获得,并开展进一步的研究。DNAmicroarray

（基因芯片）是一种用于分子生物学和医学领域的高通量技术.它由一系列成千上万个精微的DNA寡核苷酸点排列而成，这些DNA寡核苷酸含有百亿分之一摩尔特定序列的。它们或者是一小截基因，或者是DNA的其他成分。它们被作为探针，在非常严格的条件下和一个叫做靶分子的cDNA或cRNA样本杂交。由于靶分子带有荧光标记，因此通过探针-靶分子的杂交，并根据杂交后荧光的有或无

，强或弱，对靶分子中特定核酸序列的丰度进行检测。GlobalgeneexpressionanalysisinstromalPten-deletedmammaryfibroblasts1、LossofstromalPtenactivatesanEts2-dependenttranscriptionalprogram。2、StromalEts2promotesmammarytumorigenesis。3、LossofEts2diminishestumorformationinPtenstromal-deletedmammaryglands。170non-codingRNAs(ncRNAs)63HOXexons(stageIandII)QuantitativePCRHOTAIR的高表达是转移和死亡的一个有意义的判断指标关注HOTAIR（一种lncRNA，与甲基化酶PRC2复合体相结合）基因芯片的结果如何验证？Real-timePCRandRT-PCROVERVIEW组织或细胞抽提RNA逆转录反应生成cDNA实时定量PCR结果分析RNA的质量Shouldbefreeofprotein(absorbance260nm/280nm)Shouldbeundegraded(28S/18S~2:1)ShouldbefreeofDNA(DNasetreat)逆转录反应的引物Oligo(dt)Randomhexamer(NNNNNN)SpecificPCR反应的引物specifichighefficiencynoprimer-dimersIdeallyshouldnotgiveaDNAsignalcrossexon/exonboundaryEXON1EXON2INTRON2DNAEXON1EXON2RNA设置对照阴性对照(noDNA)checksreagentsforcontamination阳性对照checksthatreagentsandprimersworkespeciallyimportanceiftryingtoshowabsenceofexpressionofagene750bp

Markerbrain(+)brain()()两种标记技术染料染色SYBRGreen探针标记TaqMan探针定量原理SYBRGreen染料染料法的优缺点成本低广谱性适合初筛无模板特异性灵敏度低条件优化

研究实例（数据有所调整）

药物A可增强某种肿瘤细胞对化疗诱导凋亡的敏感性，欲研究药物A的作用机制，对药物A处理前后的细胞进行cDNAarray分析，发现药物A可诱导蛋白质CaxmRNA水平的增高。

以NorthernBlot检测Cax在各种组织中的表达，包括一些肿瘤标本。

研究实例（数据有所调整）

以NorthernBlot检测Cax在各种组织中的表达ExpressionofCAXinMouseTissuesByNorthernblotanalysismCAXBeta-actin5.5kb4.2kb

文献检索表明，Cax是一种未被研究的蛋白质，基本特点和功能不明，且序列不完整。首先可对其作一个生物信息学的分析。例如，在NCBI数据库里寻找一些信息。

*EST（BB664436）有236bp的5’端延伸，RESULTSFROMBLASTINGENEBANKPCR验证电子克隆的结果PCRPRODUCTWITHPRIMERBANDCEST(BB664436)cbc750bp

Markerbrain(+)brain()()电子克隆拼接后形成完整的5’端序列拼接产物编码的蛋白与人的CAX高度同源欲进一步研究Cax的作用机制，常用的方法是寻找与Cax相互作用的蛋白，最常用的方法为酵母双杂交（yeasttwo-hybrid)酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。GAL4为转录因子，含DBD(DNA-bindingdomain)和AD(Activatingdomain)两个结构域Cax

asbait,clonedtoGAL4-BDvectorcDNAlibrary,clonedtoGAL4-ADvector

CAX的全长cDNA序列Caxp50p65Caxp65Yeasttwo-hybrid

screening：p65（RelA）是Cax的相互作用蛋白以DBD-Cax和AD-p65共转染酵母，进一步证实它们的相互作用或体外翻译的蛋白，如35S标记的p65。InVitroBindingAssay

[GST

pull-downassay,Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶]glutathione-SepharosebeadsInVitroBindingAssay

[GST

pull-downassay,Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶]GSTorGST-CaxfusionproteinswereexpressedinE.coliBL21cellsandpurifiedwithglutathione-Sepharosebeads.pcDNA-p65wassubjectedtoinvitrotranslationtoproduceap65proteinlabeledwith

[35S]methionine.PurifiedGST-CaxorGSTproteinsbound

toglutathione-Sepharosebeadswereincubatedwith35S-labeledp65

Afterintensivewashing,thebeadswereresuspendedandsubjectedto(SDS)andautoradiography.

InputGSTGST-Cax

GSTpull-downsamplep65GST-CaxGSTBorgproteinscontrolseptinorganizationandarenegativelyregulatedbyCdc42NATURECELLBIOLOGY/VOL3OCTOBER2001GérardJoberty,RichardR.Perlungher†,PeterJ.SheffieldGSTfusionproteinswereimmobilizedonglutathione–Sepharosebeadsandincubatedwithcelllysates.NIH3T3cellswerelabelledwith[35S]methionine.Thecellextractswerecentrifugedandthesupernatantswerepreclearedwithglutathione–SepharosebeadsandincubatedwiththeGST–Borg3for20min.Beadswerewashedwiththesamebuffer.Proteinswereelutedwith20mMglutathione.GST–Borg3wasdigestedwiththrombin.Proteinswerethenseparated,digestedandidentifiedasdescribedpreviously.GSTpull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上,充当一种“诱饵蛋白”。当目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白以及体外翻译等方法获得。

His-Cax-+-+HA-p65--++

IP:Anti-HisIB:Anti-HA

Anti-His

Anti-HA

IP:Anti-HAIB:Anti-HisTotalcelllysates1234InVivoBindingAssay

(Co-mmunoprecipitation,CoIP)(免疫共沉淀)proteinA-agarosebeadsHA-p65Anti-His-IgGProteinAHis-Caxagarosebeads有时侯，抗体可以直接偶联到agarosebeads上Anti-HA-IgGHis-CaxHA-p65agarosebeadsMNO现在我们有足够的证据表明，p65是Cax的相互作用蛋白p65是转录因子NF–κB的一个亚基，NF–κB已经得到广泛深入的研究。下一步的研究应该是Cax是否参与调节NF–κB的活性，如何调节？NF-κB的激活

转录因子(transcriptionfactor)在GPCR途径中有CREB酶偶联受体：

RTK-Ras-MAPK途径中有cMyc,cJun,cFos

其他：STAT、Smad在受调蛋白水解依赖的信号转导途径中有NF-κB

在核受体信号途径中,核受体自身为转录因子。

转录因子就是基因调控蛋白，通过与DNA上基因调控序列结合，调节基因转录。在研究某些因素对NF–κB信号系统的影响的时候，分为不同层次：细胞质层次：

IκB激酶的激活（kinaseassay)IκB的降解(Westernblot)细胞核层次：NF–κB与DNA的结合能力（invitro)（EMSA)NF–κB与DNA的结合（invivo)(ChIP)NF–κB与co-activator或co-repressor的关系05101530600510153060min

VectorHis-CaxIκBα(37KD)β-actinCax对IκB降解的影响(Westernblot)制备稳定表达Cax的细胞系：逆转录病毒载体或pcDNA3G418筛选TNFα抗原等蛋白样品经SDS处理后全部带上负电荷，从而使蛋白之间仅有分子大小的差异。将少量待测蛋白样本加入夹在两块玻璃平板之间的聚丙烯酰酰凝胶顶部的加样孔中。组织或细胞的蛋白裂解产物凝胶玻璃平板将凝胶置于电场中，凝胶的底部接正极。带负电荷的蛋白向凝胶底部的正极泳动，并按分子大小的不同形成分离的条带。蛋白分子的泳动速率与分子的大小成反比，最小的多肽最先到达凝胶的底部。凝胶可以用能结合多肽的染液进行染色。最终在凝胶中显示样本中各多肽的位置。BlottingUsedtoidentifyasingleprotein/DNA/RNAmoleculeinacomplexmixturethathasbeenseparatedbygelelectrophoresisProbesarelabeledforeasyvisualizationWhenantibodiesareusedtoprobeforspecificproteinsinagel,thisiscalled“westernblotting”SouthernblottingisprobingforaDNAsequencewithaDNAprobeNorthernblottingisprobingforanRNAsequencewithaDNAprobeAntibodiesProteinsthatplayacriticalroleinhumoralimmunityTocellbiologists,theyare“tools”forresearchHighlyselectiveforspecificmoleculesEasytopurifyEasytochemicallymodifywith“tags”thatcanbevisualizedCansometimesimpactthefunctionofaproteininalivingcell(e.g.,herceptin)Polyclonalantibodies次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）胸腺嘧啶核苷激酶（TK）次黄嘌呤（hypoxanthine,H）氨甲喋呤（aminopterin,A）胸腺嘧啶核苷（thymidine,T）氨甲喋呤是叶酸的拮抗剂DAPIHis-Cax

Anti-His免疫荧光：p65可能位于细胞核或细胞质，那么Cax定位于哪里呢？亚细胞定位带标签的重组蛋白重组蛋白His-tagHA-tag共定位重组DNA技术ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＴＴＡＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＸＹＡＴＧCax与p65的细胞核共定位:TNFalpha处理2小时

Anti-p65

Anti-PML

Anti-Cax

Anti-Cax

Merge

MergeP65与Cax共定位于细胞核内对NF-kB的功能有何影响？

转录因子受到co-activator或co-repressor的调节，可以引起染色体重构，从而改变核小体的局部构象，使得转录复合体易于或不易于接近转录起始点。?Cax很可能是NF–κB的共激活因子（co-activator)或共抑制因子(co-repressor)用报告基因来检测转录因子的活化：绿色荧光蛋白2.半乳糖苷酶

3.荧光素酶(Luciferase)TitrationHis-CaxJ16Cax抑制NF–κB的转录活性5’-deletionanalysiscanidentifytranscription-controlsequencesinDNAupstreamofageneIFN-、IFN-可诱导胚胎成纤维细胞CAX的表达RT-PCR结果1000U/mlIFN-

M--+/+c6h12h24h-/-cG3PDHmCAXNorthern100U/mlIFN-

C6h12h24hC6h12h24hG3PDHmCAX+/+-/-Anelectrophoreticmobilityshiftassay(EMSA),alsoreferredasagelshiftassay,gelmobilityshiftassay,isacommontechniqueusedtostudyprotein-DNAorprotein-RNAinteractions.ThisprocedurecandetermineifaproteinormixtureofproteinsiscapableofbindingtoagivenDNAorRNAsequence,andcansometimesindicateifmorethanoneproteinmoleculeisinvolvedinthebindingcomplex.

p65NFκBbindingsites凝胶电泳迁移率变迁分析（Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）

，也称GelShift。检测转录因子与DNA结合的能力（invitro)：检测转录因子与DNA结合的能力（invitro)：凝胶电泳迁移率变迁分析（Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）

，也称GelShift。TNFα-+-+

NF-κBFreeprobeVectorHis-CaxCax不影响NFκB与DNA结合的能力（DNAbindingcapacity）核蛋白粗提物32P标记NF-κB探针1与2孵育,SDS,放射自显影检测转录因子与DNA结合的能力（invitro)：凝胶电泳迁移率变迁分析（Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）

，也称GelShift。

凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。染色质免疫沉淀分析（ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。染色质免疫沉淀技术（chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP）

研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。该技术主要应用：1.组蛋白修饰研究2.转录调控分析3.药物开发研究4.有丝分裂研究5.DNA损失与凋亡分析。下图是ChIP技术的作用原理。=p65IntactcellCrosslinkwithformaldehydeHarvestcellsSonicatetofragmentchromatinReversecrosslinkingbyheatingat65°CovernightanduseRNAseandproteinaseKtodegradeproteinandRNACheckfragmentationbyrunninganagarosegelDividechromatininto3aliquots:(1)input,(2)IPwithIgG,(3)IPwithp65antibodyPerformIP活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物将其随机切断免疫学方法沉淀Reversecrosslinkingbyheatingat65°CovernightUseRNAseandproteinaseKtodegradeproteinandRNAPurifyDNAandrunPCRontargetsequences(cyclinD)RunSDStocheckifproteinwasprecipitatedbytheantibodyspecificallyinputIgGp65IgGp65inputIgGp65Positiveprimer检测转录因子与DNA结合（invivo)：染色体免疫沉淀（chromotinimmunoprecipitation,ChIP）

InputAntip65

His-Cax

cyclinD1promoter

cyclinD1promoter

VectorIgGCax不影响NFκB与DNA的结合（DNAbinding）Anti-p65-IgGp65NFκBbindingsites

cyclinD1promoterChromotinprocessingtosmallfragments(500-600bp)Anti-p65immunoprecipitationPCRforcyclinD1promoter(containingNFκBbindingsites)细胞质层次：

IκB激酶的激活（kinaseassay)IκB的降解(Westernblot)细胞核层次：NF–κB与DNA的结合能力（invitro)（EMSA)NF–κB与DNA的结合（invivo)(ChIP)Cax对NF–κB信号系统的影响作用环节可能在co-repressor

共激活因子（co-activator)或共抑制因子(co-repressor)往往就是通过调节组蛋白的翻译后修饰实现其功能的组蛋白可以有多种翻译后修饰形式：

磷酸化乙酰化泛素化甲基化这些修饰会影响组蛋白的构象，从而影响转录复合体与DNA的结合：Histonecode引起染色体重构(Remodeling)的因子：ATP-dependantRemodelingComplexesHATorHDACComplexesHAT:histoneacetyltransferase（组蛋白乙酰转移酶）

HDAC:histonedeacetylase（组蛋白脱乙酰酶）His-CaxHis-CaxTSA，不影响Cax对NFκB的抑制作用；NAM,可解除Cax对NFκB的抑制作用。

TSA，第一、二类组蛋白脱乙酰酶（HDAC）的抑制剂；NAM,第三类HDAC的抑制剂。Cax是依赖于第三类HDAC活性的co-repressorHela细胞，anti-His纯化Cax体外表达GST-Cax,无HDAC活性Cax可募集HDAC活性（Recruitsdeactylaseactivity)CAX——HDAC活性？Anti-SIRT1Anti-HisAnti-SIRT1IPwithanti-HisTotalcelllysateVectorHis-CaxCax可募集第三类HDAC

SIRT1p50p65p50p65SIRT1CaxSIRT1药物A

已知NFκB有对抗细胞凋亡的作用，目前数据提示Cax可能通过抑制NFκB的活化，从而具有促进细胞凋亡的作用要证实这一点，需对细胞内Cax的水平进行干预，考察NFκB活化和细胞凋亡的情况干预方法：正：过度表达

负：siRNADominantNegativeMutant当然，也可以制备Cax转基因小鼠或Cax基因剔除小鼠DominantNegativeMutant(负显性突变)：对影响蛋白质功能的关键位点进行突变，所得突变体不仅丧失了原有功能，并且可以抑制内源性蛋白质的功能。例如，对Cax和SIRT1的结合位点进行研究后，发现某个位点的氨基酸对Cax募集SIRT1的功能非常重要，该氨基酸突变后，Cax丧失了募集SIRT1的功能。进一步研究发现，CaxM具有负显性功能，可促进NF–κB的激活,其机制可能是对内源性Cax的竞争性抑制。Anti-SIRT1Anti-HisAnti-SIRT1IPwithanti-HisTotalcelllysateVectorHis-CaxHis-CaxM

ControlTNFLuciferaseactivity(fold)VectorHis-CaxHis-CaxMp50p65p50p65SIRT1内源性CaxSIRT1外源性CaxM内源性Cax?siRNA(smallinterferingRNA)或RNAi(RNAinterference)的原理siRNA的设计:可进入各生物公司网站在线设计或请专业公司设计siRNA如何转入细胞:瞬时和稳定转染siRNA效果鉴定:NorthernBlot或WesternBlotCax沉默促进由TNFalpha刺激引起的NFκB-依赖的转录CaxAnnexinV-FITCPIControl药物A+化疗药

CaxsiRNA

ControlsiRNACaxsilencingdecreasestheapoptoticcellsp50p65SIRT1内源性CaxCaxreconstitutioncouldrescuetheapoptoticsusceptibilityofcellstoTNFCax*isresistantfordegradationinducedbysiRNA.ItssequencehasmultiplenucleotidesubstitutionswithinthesiRNAbindingsite,butretainthecodingofidenticalaminoacidsasthewildtypeCax,toallowforreconstitutioninthesiRNAenvironmentHis-Cax*Anti-His

WT:5’CAAAGCGTGGACCTGGTCTTCCCT3’;Mutant:5’CAgtcCGTaGattTaGTaTTtCCg3’

forthesameaminoacidssequence:QSVDLVFP

现在我们可以得出结论:1.Cax具有促进细胞凋亡的作用2.药物A通过诱导Cax表达的增加,增强肿瘤细胞对化疗诱导凋亡的敏感性3.Cax促进细胞凋亡的机制可能是抑制了NFκB的激活基因打靶原理:

生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。同源重组(Homologousbination)又称一般性重组或非特异性重组(Generalbination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程,外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。XpPNT－mCAX基因敲除载体ES细胞电穿孔，筛选同源重组克隆ES细胞囊胚注射，嵌合体小鼠的产生基因剔除流程图嵌合体小鼠回交，获得杂合子小鼠(胸苷激酶蛋白)TK可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。CAX小鼠基因型的检测策略Southernblot+/+-/-+/-22.86kb22.86/9.9kb9.9kbBh2.1Kb2.5KbprobeBhBh8.1kb1.8kb22.86kb6.4kbabcd同源重组阳性的ES细胞鉴定结果ES细胞阳性克隆

5195MCAX的嵌合体小鼠CAX小鼠基因型的检测策略PCR+/+-/-+/-2.8kb1.5/2.8kb1.5kbBh2.1Kb2.5KbprobeBhBh8.1kb1.8kb22.86kb6.4kbabcdCAX小鼠后代的基因型检测结果F1代鉴定结果F3代鉴定结果a/bprimera/bprimerc/dprimerInactivationofCAXthroughHomologousbinationG3PDHmCAXM+/++/++/-+/--/--/-ＣＡＸ剔除小鼠的杂合子后代符合孟德尔的遗传规律ＣＡＸ-/-小鼠的胚胎发育正常对出生后小鼠的观察表明，ＣＡＸ-/-小鼠的形态、生长、繁殖无明显异常条件性基因打靶LoxP（locusofX-overP1）序列：5'-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3'3'-TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA-5'Cre重组酶：能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；

2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；Brainbowinvivo神经系统中荧