动物细胞工程课件-002

动物细胞工程应用龙江一中李启国

动物细胞工程应用龙江一中李启国1动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植动物细胞工程常用技术动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植动物细胞工程常用2皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，10～14天后就要被身体排斥。

如果一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚3人耳鼠“人耳鼠”再出风头2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动——这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。

在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。

人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？人耳鼠“人耳鼠”再出风头在京展出的数天，尽管门票高达4一、动物细胞培养1.发展历史:20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。一、动物细胞培养1.发展历史:52、动物细胞培养的应用和概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.2、动物细胞培养的应用和概念：动物细胞培养就是6动物细胞的培养过程

幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养单个细胞动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础剪碎组织的目的？胰蛋白酶处理的目的？动物细胞的培养过程幼龄动物取动物器官剪碎组织胰蛋白酶处理细7动物细胞工程课件_0028有关概念原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。（分装前的细胞培养）传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。有关概念原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。（分9有关概念

细胞株：传代培养的细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。

细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。

细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。有关概念细胞株：传代培养的细胞一般传至10代左右细胞生长10动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液10代细胞50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液（分解弹性纤维）原代培养胰蛋白酶剪碎细胞株细胞系动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。遗传物质未改变遗传物质已改变3、动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液10代细胞50代细胞11动物组织细胞培养要求一体外培养特点:大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。动物组织细胞培养要求一体外培养特点:12二、培养条件

细胞在体外培养中所需的条件

与体内细胞基本相同。

【讨论】多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？提示：无菌、无毒的环境。二、培养条件

细胞在体外培养中所需的条件

与体内细胞基本相同131）恒定的温度:37℃，

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低1）恒定的温度:37℃，

维持培养细胞旺盛生长，必须有142）PH：7.2-7.４当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。用来检测PH的变化：红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。2）PH：7.2-7.４当PH低于6或高于7.6时的生长会受153)气体：二氧化碳有调节PH的作用。氧气为生物新陈代谢所必须气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。

3)气体：二氧化碳有调节PH的作用。164）营养—培养基：在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物,促生长因子，微量元素及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。4）营养—培养基：在保证细胞渗透压的情况下，培175)、无污染环境

培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。

5)、无污染环境

培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要18三.动物细胞培养技术的应用蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体健康细胞培养培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植细胞的生理、药理、病理研究

用于筛选抗癌药物

三.动物细胞培养技术的应用蛋白质生物制品的生产19植物组织培养和动物细胞培养的比较细胞的全能性细胞增殖固体培养基液体培养基蔗糖植物激素葡萄糖动物血清植物体细胞株、细胞系快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白植物组织培养和动物细胞培养的比较细胞的全能性细胞增殖固体培养201、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？２、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？３、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？４、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？没有是成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理。思考题1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？２、动物细胞培21６、细胞膜的主要成份是什么？７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？８、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？蛋白质和磷脂能注意时间的控制思考题５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？胰蛋白酶水解蛋白质细胞间的成份是蛋白质６、细胞膜的主要成份是什么？７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？８22９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？１０、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？不能，因为两者的最适pH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适pH较接近胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛思考题９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？１０、动物细胞培养2311、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？易于培养细胞贴壁，进行生长增殖当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。这样的过程叫做传代培养思考题11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？12、培养瓶中的2414、如何理解原代培养和传代培养？15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？16、有些为何能一直传下去？17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养不都能发生突变，朝着癌细胞方向发展不全是思考题14、如何理解原代培养和传代培养？15、传代培养的细胞能一直2518、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？保存10代以内的细胞，因为10－50部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展。细胞培养耗费大量物力、人力、财力，因此及时冻存细胞很有必要，通常情况下，10代以内的细胞可以冷冻保存，-70℃可以保存一年，或者保存于液氮中。复苏细胞应采用37度水浴快速复苏的方法。思考题19、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？保存10代以内的细26一、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、动物细胞全能性的表现程度不同受精卵>胚胎干细胞>多能干细胞>单能干细胞>体细胞一、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、动物细胞全能性的表现程27核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植（难度高）2、动物体细胞核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体。核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植（难度高）2、动物283.培育过程去核卵细胞体细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期胚胎(或重组胚胎）胚胎移植母体子宫妊娠、出生个体4、原理动物体细胞核具有全能性3.培育过程去核卵细胞体细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早29卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎30二.体细胞核移植技术的应用前景二.体细胞核移植技术的应用前景31动物体细胞核移植是一种无性繁殖技术，用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。其意义：1、有利于遗传疾病的治疗，优良品种的培育2、对物种的优化、濒危动物的保护和转基因动物的扩群有重要意义3、降低畜牧业的成本，缩短育种年限，提高生产效率动物体细胞核移植是一种无性繁殖技术，用核移植的方法得到的动物32体细胞核移植技术存在的问题：克隆的成功率低许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。体细胞核移植技术存在的问题：克隆的成功率低33

1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞（）

A．细胞系B．细胞株C．原代细胞D．传代细胞2、动物细胞工程技术的基础是-----（）A.动物细胞融合B.单克隆抗体C.胚胎移植D.动物细胞培养

AD

3.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于----（）A.培养基不同；B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株。A教学反馈1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞（）34动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体35小结两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法－－灭活病毒一个新细胞－－杂交瘤细胞一个优势－－单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势小结两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个36一、动物细胞融合

细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合受精作用一、动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合受37动物细胞融合动物细胞融合38细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法化学法仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法仙台病毒39用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核40细胞融合与融合诱导细胞融合物质诱导剂：仙台病毒聚乙二醇

电融合诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活。

细胞融合与融合诱导细胞融合物质诱导剂：仙台病毒41二、单克隆抗体什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。二、单克隆抗体什么是抗体？42B淋巴细胞与抗体

１．B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。２．动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。３．每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。B淋巴细胞与抗体１．B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体43单克隆抗体由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。

特点：

特异性强、灵敏度高

单克隆抗体由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基44如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能45

单克隆抗体制备过程

注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融46思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物47单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：1、临床诊断2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤

资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，48植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较49动物的胚胎移植解决某些妊娠时间长、每胎产子数量少的优良种畜的繁殖速度问题。动物的胚胎移植解决某些妊娠时间长、每50胚胎移植技术试管动物（婴儿）培养过程卵细胞精子体外受精受精卵胚胎新个体母体子宫内孕育、产出胚胎移植技术试管动物（婴儿）培养过程卵细胞精子体外受精受精卵51植物细胞工程植物细胞工程52植物细胞工程的基本技术和理论基础植物细胞工程的理论基础是：

植物细胞的全能性植物细胞工程常用的技术是植物组织培养植物体细胞杂交概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。原因：是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质及发育为完整个体所必需的全部基因。植物细胞工程的基本技术和理论基础植物细胞工程的理论基础是：53细胞的全能性当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态。受精卵的全能性最高；其次是生殖细胞（尤其是卵细胞）；体细胞的全能性比生殖细胞低得多。

细胞的全能性当植物细胞脱离了原来所在植物体的54植物组织培养的概念植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。植物组织培养的概念植物组织培养就是在无菌和人55植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞脱分化（又叫去分化）愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）再分化根或芽等器官植物体植物组织培养的条件：适宜的养料和激素，适宜的温度和无菌条件植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞脱分化（又叫去分56离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根芽植物体脱分化再分化脱分化由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。再分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细胞的再分化。二、植物组织培养植物组织培养过程离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根植物体脱分化再分化脱分化57动物细胞工程课件_00258相关问题1、在植物组培过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？2、为什么切取胡萝卜根的形成层，其他部分也能培养成小植株吗？相关问题1、在植物组培过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌59植物体细胞杂交的概念将不同种植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。（不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的）植物体细胞杂交的概念将不同种植物的体细胞，在60相关问题（1）要想让两个来自不同植物的体细胞融合在一起，遇到的第一个障碍是什么？（2）有没有一种温和的去细胞壁的方法？（3）为什么两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的什么特性有关？（4）如果两个来源不同的原生质体发生融合形成了杂种细胞，下一步该对此细胞做何种处理？（5）如何将杂种细胞培育成杂种植株？相关问题（1）要想让两个来自不同植物的体细胞融合在一起，遇到61植物体细胞杂交过程植物细胞A植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体A原生质体B原生质体融合杂合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞细胞分裂分化发育愈伤组织杂种植株植物体细胞杂交过程植物细胞A植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁原62植物体细胞杂交过程原生质体制备（酶解法去细胞壁）原生质体融合（人工诱导）

杂种细胞的筛选和培养（形成愈伤组织）杂种植株的再生与鉴定物理法：离心、振动、电刺激等化学法：聚乙二醇等试剂纤维素酶、果胶酶等植物体细胞杂交过程原生质体制备（酶解法去细胞壁）物理法：离心63问题为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯—番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。问题为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那64问题自然界中有一种含有叶绿体的原生动物──眼虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活，请探讨：动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出具体实验方案。问题自然界中有一种含有叶绿体的原生动物──眼虫，说明植物的细65异想天开异想天开66植物细胞工程的实际应用繁殖植物的新途径微型育种作物脱毒人工种子育种新方法单倍体育种诱导突变体细胞产物的工厂化生产植物细胞工程的实际应用繁殖植物的新途径67概念：应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技术）原理：植物细胞的全能性优点：繁殖率高，可大批量生产取材少培养周期短保持优良性状微型繁殖概念：应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技术）微型68作物脱毒病毒在作物体内逐年积累，会导致作物产量降低，品质变差分生区附近（茎尖、根尖）的病毒极少，甚至没有采用茎尖进行组织培养作物脱毒病毒在作物体内逐年积累，会导致作物产量降低，品质变差69人工种子结构：人工薄膜+胚状体（不定芽、顶芽、腋芽）优点：不受气候、季节、地域的限制保留优良性状时间短，占地少技术：组织培养原理：细胞全能性人工种子结构：70养分、无机盐、有机碳源、农药、抗生素、有益菌生长调节剂养分、无机盐、有机碳源、农药、抗生素、有益菌71单倍体育种方法：花药离体培养技术：组织培养获得单倍体秋水素处理单倍体的幼苗，使染色体加倍优点：明显缩短了育种年限后代稳定遗传单倍体育种方法：72突变体的利用利用组织培养时，分裂状态的细胞易受培养条件和外界压力（如射线，化学物质等）的影响而产生突变的原理，诱导并筛选出对人类有用的突变体。突变体的利用利用组织培养时，分裂状态的细胞易受培养条件和外界73细胞产物的工厂化生产红豆杉与紫杉醇人参皂甘的生产细胞产物的工厂化生产红豆杉与紫杉醇人参皂甘的生产74植物细胞工程的实际应用繁殖植物的新途径微型育种作物脱毒人工种子育种新方法单倍体育种诱导突变体细胞产物的工厂化生产植物细胞工程的实际应用繁殖植物的新途径75动物细胞工程应用龙江一中李启国

动物细胞工程应用龙江一中李启国76动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植动物细胞工程常用技术动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植动物细胞工程常用77皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，10～14天后就要被身体排斥。

如果一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚78人耳鼠“人耳鼠”再出风头2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动——这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。

在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。

人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？人耳鼠“人耳鼠”再出风头在京展出的数天，尽管门票高达79一、动物细胞培养1.发展历史:20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。一、动物细胞培养1.发展历史:802、动物细胞培养的应用和概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.2、动物细胞培养的应用和概念：动物细胞培养就是81动物细胞的培养过程

幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养单个细胞动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础剪碎组织的目的？胰蛋白酶处理的目的？动物细胞的培养过程幼龄动物取动物器官剪碎组织胰蛋白酶处理细82动物细胞工程课件_00283有关概念原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。（分装前的细胞培养）传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。有关概念原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。（分84有关概念

细胞株：传代培养的细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。

细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。

细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。有关概念细胞株：传代培养的细胞一般传至10代左右细胞生长85动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液10代细胞50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液（分解弹性纤维）原代培养胰蛋白酶剪碎细胞株细胞系动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。遗传物质未改变遗传物质已改变3、动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液10代细胞50代细胞86动物组织细胞培养要求一体外培养特点:大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。动物组织细胞培养要求一体外培养特点:87二、培养条件

细胞在体外培养中所需的条件

与体内细胞基本相同。

【讨论】多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？提示：无菌、无毒的环境。二、培养条件

细胞在体外培养中所需的条件

与体内细胞基本相同881）恒定的温度:37℃，

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低1）恒定的温度:37℃，

维持培养细胞旺盛生长，必须有892）PH：7.2-7.４当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。用来检测PH的变化：红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。2）PH：7.2-7.４当PH低于6或高于7.6时的生长会受903)气体：二氧化碳有调节PH的作用。氧气为生物新陈代谢所必须气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。

3)气体：二氧化碳有调节PH的作用。914）营养—培养基：在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物,促生长因子，微量元素及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。4）营养—培养基：在保证细胞渗透压的情况下，培925)、无污染环境

培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。

5)、无污染环境

培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要93三.动物细胞培养技术的应用蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体健康细胞培养培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植细胞的生理、药理、病理研究

用于筛选抗癌药物

三.动物细胞培养技术的应用蛋白质生物制品的生产94植物组织培养和动物细胞培养的比较细胞的全能性细胞增殖固体培养基液体培养基蔗糖植物激素葡萄糖动物血清植物体细胞株、细胞系快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白植物组织培养和动物细胞培养的比较细胞的全能性细胞增殖固体培养951、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？２、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？３、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？４、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？没有是成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理。思考题1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？２、动物细胞培96６、细胞膜的主要成份是什么？７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？８、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？蛋白质和磷脂能注意时间的控制思考题５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？胰蛋白酶水解蛋白质细胞间的成份是蛋白质６、细胞膜的主要成份是什么？７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？８97９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？１０、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？不能，因为两者的最适pH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适pH较接近胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛思考题９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？１０、动物细胞培养9811、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？易于培养细胞贴壁，进行生长增殖当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。这样的过程叫做传代培养思考题11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？12、培养瓶中的9914、如何理解原代培养和传代培养？15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？16、有些为何能一直传下去？17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养不都能发生突变，朝着癌细胞方向发展不全是思考题14、如何理解原代培养和传代培养？15、传代培养的细胞能一直10018、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？保存10代以内的细胞，因为10－50部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展。细胞培养耗费大量物力、人力、财力，因此及时冻存细胞很有必要，通常情况下，10代以内的细胞可以冷冻保存，-70℃可以保存一年，或者保存于液氮中。复苏细胞应采用37度水浴快速复苏的方法。思考题19、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？保存10代以内的细101一、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、动物细胞全能性的表现程度不同受精卵>胚胎干细胞>多能干细胞>单能干细胞>体细胞一、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、动物细胞全能性的表现程102核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植（难度高）2、动物体细胞核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体。核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植（难度高）2、动物1033.培育过程去核卵细胞体细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期胚胎(或重组胚胎）胚胎移植母体子宫妊娠、出生个体4、原理动物体细胞核具有全能性3.培育过程去核卵细胞体细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早104卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎105二.体细胞核移植技术的应用前景二.体细胞核移植技术的应用前景106动物体细胞核移植是一种无性繁殖技术，用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。其意义：1、有利于遗传疾病的治疗，优良品种的培育2、对物种的优化、濒危动物的保护和转基因动物的扩群有重要意义3、降低畜牧业的成本，缩短育种年限，提高生产效率动物体细胞核移植是一种无性繁殖技术，用核移植的方法得到的动物107体细胞核移植技术存在的问题：克隆的成功率低许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。体细胞核移植技术存在的问题：克隆的成功率低108

1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞（）

A．细胞系B．细胞株C．原代细胞D．传代细胞2、动物细胞工程技术的基础是-----（）A.动物细胞融合B.单克隆抗体C.胚胎移植D.动物细胞培养

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3.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于----（）A.培养基不同；B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株。A教学反馈1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞（）109动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体110小结两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法－－灭活病毒一个新细胞－－杂交瘤细胞一个优势－－单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势小结两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个111一、动物细胞融合

细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合受精作用一、动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合受112动物细胞融合动物细胞融合113细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法化学法仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法仙台病毒114用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核115细胞融合与融合诱导细胞融合物质诱导剂：仙台病毒聚乙二醇

电融合诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活。

细胞融合与融合诱导细胞融合物质诱导剂：仙台病毒116二、单克隆抗体什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。二、单克隆抗体什么是抗体？117B淋巴细胞与抗体

１．B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。２．动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。３．每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。B淋巴细胞与抗体１．B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体118单克隆抗体由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。

特点：

特异性强、灵敏度高

单克隆抗体由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基119如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能120

单克隆抗体制备过程

注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融121思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物122单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：1、临床诊断2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤

资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，123植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较124动物的胚胎移植解决某些妊娠时间长、每胎产子数量少的优良种畜的繁殖速度问题。动物的胚胎移植解决某些妊娠时间长、每125胚胎移植技术试管动物（婴儿）培养过程卵细胞精子体外受精受精卵胚胎新个体母体子宫内孕育、产出胚胎移植技术试管动物（婴儿）培养过程卵细胞精子体外受精受精卵126植物细胞工程植物细胞工程127植物细胞工程的基本技术和理论基础植物细胞工程的理论基础是：

植物细胞的全能性植物细胞工程常用的技术是植物组织培养植物体细胞杂交概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。原因：是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质及发育为完整个体所必需的全部基因。植物细胞工程的基本技术和理论基础植物细胞工程的理论基础是：128细胞的全能性当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态。受精卵的全能性最高；其次是生殖细胞（尤其是卵细胞）；体细胞的全能性比生殖细胞低得多。

细胞的全能性当植物细胞脱离了原来所在植物体的129植物组织培养的概念植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。植物组织培养的概念植物组织培养就是在无菌和人130植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞脱分化（又叫去分化）愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）再分化根或芽等器官植物体植物组织培养的条件：适宜的养料和激素，适宜的温度和无菌条件植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞脱分化（又叫去分131离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根芽植物体脱分化再分化