SDS-PAGE电泳分离蛋白质与蛋白质免疫印迹

SDS-PAGE电泳分离蛋白质与蛋白质免疫印迹■蛋白免疫印迹杂交(WesternBlot)是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜(blot)上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂N,N,N\N，一四甲基乙二胺（简称TEMED）和催化剂过硫酸铁（简称AP）作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。ProteinsonblotseparatedbysizeEpitopeTaggedProteinorColorSpecificProteinBand\ProteinsonblotseparatedbysizeEpitopeTaggedProteinorColorSpecificProteinBand\rEpitopeAntibodylinkedtoenzymeProteinBloton

NilroctflluloseSDSPolyacrylamide

GelElectrophoresis:I^belwithSpecific30%丙烯酰胺的配制1、称量Acrylamide290g,Bis10g,置于1L烧杯中2、向烧杯中加入约600ml的去离子水，充分搅拌溶解。3、加去离子水将溶液定容至1L,用0.45mm滤膜滤去杂质。4.于棕色瓶中4℃保存。・・吸等可意肤箸注皮口为丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过・・吸等可意肤箸注皮口为■凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。表3.4分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质20-3015-2020-3015-2010-155-102-510-40KD10-100KD100KD>500KD分离胺的聚合（12%）51nl体系蒸懦水1.634mlTOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"30%丙烯酰胺2.0ml1.5MpH8.8Tris-SDS3.7ml10%AP25ulTEMED5ul上层加异丙醇压股，室温一小时积层胶的聚合(5%)2.5ml体系蒸瑞水1.75ml30%丙烯酰胺0.413ml1MpH6.8Tris-SDS0.338ml10%APTEMED10%APTEMED2.5ul室温一小时

下电极上极槽下电极缓冲液pH=8.3Tris-甘样品胶］H=6.7Tns-HC1浓缩胶J分离胶PH=8.9Tris-HC1缓冲液pH=8.3Tris-甘过程图http7/48/newkj/my/moban2/index.htmWebernBlot聚丙烯酹月方疑股电法■转膜■孵育1小时或过夜.孵育抗

孵育1小时或过夜1d'W

■

CUM3x5分丰中1X10分钟

.M底粉（如为显色法，则苴接孵育至显色艮阿）1分钟胶片暴光显观1-30分车中（―）方法1、制胶：制备凝胶板，将混合后的分离胶溶液，用1ml枪加至距梳齿卜缘约1cm。用1mL枪在凝胶表而沿短玻璃板边缘轻轻加一层异丙醇（约高3-4mm）,用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有•折射率不同的界线。将异丙醇倒去川重蒸水洗净胶而，将混合均匀后的浓缩胶溶液加入分离胶上方，轻轻插入梳子.待上层胶聚合，拔出梳子，放入电泳槽，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.3cm,即可加样。2、样品处理：样品经反复冻融裂解，离心，测浓度后，向样品中加入适量的上样缓冲液6*SDS,金属浴105°C10min,加样量一般每个样品池10~4053、电泳将电泳仪与电源接通，打开电泳仪稳流，开始时电流约20mA,待样拈进入分离胶后，将电流调至25-30mA,当澳酚蓝染料距底框0.5cm时，停止电泳，关闭电源4、染色与脱色、电泳结束后，取下凝胶板，用胶铲撬开短玻璃板，丛凝胶板上切下•角作为加样标记。加入染色液染色h,再加自来水（加几滴3MKCI）煮沸三次（10min/次）脱色,则可见蛋白质区带清晰。5、转移电泳：凝胶电泳结束前30min,将PDVF膜浸泡在转移缓冲液中。从模具中取出凝胶放在PDVF膜上，驱除气泡，然后置于滤纸上放入转移模具中，将模具放入转移电泳槽,PDVF膜一面朝正极，恒压100伏70min,4℃电泳过夜，次日取出PDVF膜做好标记。七、抗体杂交抗体表面全要采用间接法。即先加入未标记特异性抗体与膜上抗原结合，再加入标记的抗体进行杂交检测，标记二抗物质有放射性核素、酶以及生物素等。杂交过程：1)封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的一抗，封口，4℃孵育过夜或室温(22-25℃)摇动孵育2h.)液洗膜3次xIOmin)标记的二抗室温1h,洗膜3x10min八、检测根据标记二抗的标记物不同，其杂交的结果检测方法也不同，较常用的检测系统有增强化学发光(ECL)和DAB检测］系统.1)辣根过氧化物酶-DAB法：①DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C各1滴,混匀.②显色:将适量DAB显色液平铺在二抗杂交后的印迹膜上,室温放置观察，可出现明显的棕褐色蛋白显色带③终止:用Tris-HCI缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应.2)辣根过氧化物iW・ECL法：增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质，生成一种不稳定的中间物质，其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用X线胶片感光原理，将结果记录下来。ECL显色剂配制：按EP管中加显色剂A、B各1滴,混匀，在暗室将杂交后迹膜放入显色盒中，加上混合好的显色液，反应1-5分钟，用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的显色液，将一透明的保鲜膜盖住抚平，并确定干的表面与胶片接触。将印迹膜在暗室中使胶片暴光1-5分钟，冲洗胶片以确定所测抗原的正确暴光时间，暴光时间可短至几秒也可以长到数小时。冲洗胶片步骤：先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止，在放入定影液中漂洗，十秒即可。考马斯亮蓝和DABCoomusUebluestainedgelVMesternblot考马斯克蓝染色：将凝胶取出放入培养皿中加入少量的染色液，以浸没凝胶为宜，在摇床CoomusUebluestainedgelVMesternblot考马斯克蓝染色：将凝胶取出放入培养皿中加入少量的染色液，以浸没凝胶为宜，在摇床上震荡，直到凝胶上出现明显的条带为止，一般5-6小时或者4c过夜.然后倾去染色液，用脱色液洗涤宸荡，其间要不断换脱色液，宜至脱色液颜色稍清亮，凝胶背景清楚为止。DAB整色常见问题及解决方案D富见问鉴分析与解决方案诩S可能原因婺证或解决办法封闭不充分延长封闭时间）更换合适用圉闭剂（脱脂馈，0SA,山清等）卜抗侬度过高增加一抗敏倍数.SU幅温度过高时孵育卜景高二抗聿特融船或与封闭剂减购设置二抗龙照不加1抗）,降低二抗浓度一抗或二抗与封闭剂在孵窗1曲瑕中加入Twe印-2。有殳义反应以减姆摩应.洗腹不充分增加蟒燔膜不合适何。腹比PVDF厘背景保膜二燥保证充分的反应液7避免出现千展现象L一抗、二抗等不匹配仃购试剂时认真选取一抗与组织种即一抗与二抗或施底潴系统之间相瓯诙这及底枷可通过设置内参可以西收检解统的有雌.L一抗或加二抗浓度低增加抗体浓度，至侬能间2搁肺一抗或二抗有交叉反应封闭时使用温僦去污剂,WEEN20,或更投封痫（献翩、BSAU清或明胶L一抗不识别目的物种的靶蛋白查说明书,或彼ClustalW比对j设阳用■沿硒性条带设置阳性对照，尤薪日性对照有给果，但标本没有则可能A钙中无靶蛋白或靶蛋白含物位科不含杷蛋白或嘘E一太能后者可增加科上稻抗飘效）旃孔20・30喳白件制备时使用蛋白陶雕杯国分^目的蛋白。或很弱sV考段不充分,或洗膜过度婢用丽春红睹峭重燃FVDF膜需浸透需正宿辨^须度洗脱:境封闭陵含0.5%脱麒婚脱检腾航体㈱液或电囹解用闭时间L一抗劫使用有效期内抗俗分装保存避免反复冻融取用工作醐E用L;抗程氮蒯制所用溶液和容器中窗曳含有屈氮钠（HR用时稀骄JE轨就失效直接懒和底辘醛合，如果猛色则说明掠烯11归有效期内、有活域颖物,使用新鲜的底物.1卜既牺过短窕长曝光时间

舞髅数过—表达使用原始或他少禄曜株，或平行实聆徐丙表东苗雷白样云目有名钟修饰形式：乙酰化.洪防化、甲基化、烷基化、糖基化等查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正逢的大小重白样本璘解使用新鲜格播的标本,并使用蜜白的4解济厂多非特异性条带新蛋白或叵族蜜白的分享同种表位查其它文频导，琪BLAST搜寻，使用说明书报导的细胞;的不同剪搂方式画一抗纭度过高降低抗体浓度,可LN更少非特异性条带或条带位置不对二抗浓回高产生非特异性结合降低抗体浓度，增加二抗对照选择特异性更走，只针对重施的一抗抗体耒纯化使用单克隆或亲和纯化“抗住,说？非畤异条带蛋白存在二聚体或多聚体SDS・PAGE电泳上样前，以增强蛋白质箫聚变性煮沸10min，背景有白色，黑色斑转翌时有铀或抗体分布不为尽量去除气泡，抗瘁强肯时保持据动点抗体与鸟闵剂络合过滤封闭剂暗片现白条带一抗或二抗加入过多福球抗体的侬金目的条带过低归高SD4PAGE®海度选择不合适调整胶浓度，分子量大的蛋白月低浓度胶，分子量小的蛋I高侬度胶“微笑”条带迁移过快电泳温度过高降低电泳速度，低温电泳（冷室）膜没有挺均匀湿透使用100%melh3noi浸透膜5p->泊籽量小于10.000选择小孔径雕，络瞬珞时间转朦不充分罐U等电点等于或接近转微冲iSpHfi可尝试使用其他短冲液如CAP盘冲浪（pH1”谏使用IE媛冲液如乙懒冲液帮浓度过高过高甲苫浓度总导致金白质与SDS分罂，从而沉题凝网同时会使凝踪缩或变硬，从而抑带睛分子量蛋白的转移,低甲等侬度辘便用乙醇或异丙修惘转移时间相Thickgel对于屋的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间

S»cn^c(dYarrodSiond(vd -91SahWo»hS»cn^c(dYarrodSiond(vd -91SahWo»h-注意事项：.免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。因此，凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用，或者建议做一次梯度稀释，上样电泳后，直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量。.形成凝胶的试剂要有足够的纯度，激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量,凝胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。因此，建议要根据不同温度下'适量增减激活剂的川量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳，对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合。灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合。.未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套口罩防护。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡，可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生，梳子拔出来时应该小心，不要破坏加样孔，如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正，但要避免针头刺入胶内。.电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺，同时建议低电压短时间的预电泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通（恒压10-20V,20-30min）.加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以减少蛋白