仪器分析课件-11-高效液相色谱法

仪器分析河北工业大学仪器分析河北工业大学第十一章高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography（HPLC）第十一章高效液相色谱法HighPerformance2ThermoFisherUltimate3000高效液相色谱仪ThermoFisherUltimate30003

流动相为液体的色谱称为液相色谱。20世纪70年代初，吉丁斯（J.C.Giddings）将气相色谱速率理论引入到液相色谱，并在速率理论的指导下，对经典液相色谱做了重大改进，发展了高效液相色谱法，目前它已成为现代仪器分析中最重要的分离分析方法之一。流动相为液体的色谱称为液相色谱。411-1概述一、HPLC的特点与经典的液相色谱法相比，HPLC在技术上采用了高效固定相、高压泵、高灵敏度检测器，提高了柱效，加快了分析速度，实现了自动化检测，其主要特点有：（1）高压为了提高柱效，HPLC固定相颗粒极细，填充十分紧密，载液流经色谱柱时受到的阻力很大，为了较快地通过色谱柱，必须对载液施加15~35MPa、甚至高达50MPa的高压。（2）高速高效液相色谱配备了高压输液设备，且采用短柱，在分析速度上比经典液相色谱法快得多。例如分离氨基酸，用经典色谱法，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，l小时之内即可完成。11-1概述一、HPLC的特点与经典的液相色5（3）高效经典液相色谱的柱效为10~100塔板/米，而HPLC由于使用了高效固定相，其柱效可高达104~106塔板/米；同时，计算机技术的引入也使分离操作和数据处理效率大大提高。（4）高灵敏度

HPLC采用了高灵敏度的检测器，大大提高了检测灵敏度。如荧光检测器最小检测限可低至0.01ng。此外，其进样量也很少，用μL级的样品便可进行全分析。（5）应用范围广既能分析一般化合物，也能分析沸点高、热稳定性差和具有生理活性的物质，还能分析离子型化合物和高聚物。此外，还适宜制备高纯试剂。

HPLC与其他仪器的联用是一个重要的发展方向，如HPLC-MS、HPLC-IR、HPLC-NMR等联用技术。（3）高效经典液相色谱的柱效为10~100塔板/米，6二、HPLC与GC的比较

HPLC与GC的基本概念和理论是基本一致的，但HPLC所用的流动相、固定相、分析对象、仪器设备和操作条件等于GC不同。（1）流动相

GC-载气，对组分和固定相呈惰性，专门用来载送样品，只有固定相能与组分分子作用。而HPLC-载液，对组分分子有一定的亲和作用，能与固定相争夺组分分子，因而增大了分离的选择性。GC载气的种类少，HPLC载液种类多，并可灵活调节其极性、离子强度或pH值，为选择最佳分离条件提供方便。二、HPLC与GC的比较HPLC与GC的基7（2）固定相

GC分离的选择性主要是通过选用不同的固定相来实现，所以GC固定相种类繁多，已有数百种。常用的HPLC固定相仅有十几种，其分离选择性在很大程度上要通过选用不同的流动相来改变。GC一般是选定一种载气，然后通过改变固定相及操作参数（柱温和载气流速）来优化分离，而HPLC则相反。此外，GC固定相粒径较大，70~250μm，HPLC固定相粒径较小，3~30μm，所以HPLC比GC柱效高得多。（2）固定相GC分离的选择性主要是通过选用不同的固定8（3）分析对象

GC的分析对象是在操作温度下能气化而不分解的物质，在已知的有机物中，只有20%能用GC分析；HPLC适合于分子量较大、难气化、不易挥发或热不稳定物质、离子型化合物、高聚物等，有大约80%有机物能用HPLC进行分离分析。（4）分离温度

GC一般在高于室温下分离，最高可达300~400℃；HPLC的分离温度一般为室温或略高于室温。（3）分析对象GC的分析对象是在操作温度下能气化而不9（5）色谱柱

GC柱较长较粗，如填充柱内径2~6mm，长1~10m，毛细管柱内径0.1~0.5mm，长10~100m；HPLC柱较短较细，如常规柱长一般为15~30cm，内径1~6mm。（6）流动相驱动力

GC一般采用高压载气，HPLC常采用高压泵。此外，为了提高分离效能，缩短分析时间，GC常采用程序升温的办法，HPLC采用梯度洗脱方式。（5）色谱柱GC柱较长较粗，如填充柱内径2~6mm，1011-2高效液相色谱仪高效液相色谱仪主要由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测和记录系统四大部分组成。其工作过程为：贮液器中的载液经高压泵输送到色谱管路中，试样由进样器注入流动相，流经色谱柱进行分离，分离后的各组分由检测器检测，输出信号由记录仪记录下来，即得到液相色谱图。11-2高效液相色谱仪高效液相色谱仪主要11高压输液系统进样系统分离系统检测和记录系统高压输液系统进样系统分离系统检测和记录系统12一、高压输液系统1、贮液器贮液器用来贮装载液，一般由玻璃、不锈钢或聚四氟乙烯制成，容量为1~2L。贮液器应带有脱气装置，以便有效脱除溶于载液中的气体，从而避免基线噪声增大和基线不稳的情况发生。一、高压输液系统1、贮液器132、高压泵

HPLC色谱柱柱径较细，固定相颗粒细小，再加上液体粘度较大，因此柱内阻力较大。因此必须用高压泵输送载液，才能达到快速分离的目的。一般要求泵的输出压力为15~50MPa。2、高压泵14高压输液泵根据其排液性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。目前绝大多数高压液相色谱所采用的是往复式柱塞恒流泵。高压输液泵根据其排液性质可分为恒压泵和恒流泵153、梯度洗脱装置

梯度洗脱是将两种或两种以上不同性质，但可以互溶的溶剂，随时间改变而按一定比例混合，以连续改变色谱柱中载液的极性、离子强度或pH值等，从而改变被测组分的保留值，提高分离效率，加快分析速度，使样品中各组分都能在最佳的分离条件下出峰。梯度洗脱特别适合于样品中组分k值范围很宽的复杂样品的分析。内梯度外梯度3、梯度洗脱装置内梯度外梯度16梯度洗脱和GC中的程序升温非常类似。相同点：作用相同，都可以改善复杂样品的分离效果。不同点：GC中的程序升温是通过程序改变柱温，使柱温按一定速率升高；而HPLC中的梯度洗脱是通过改变流动相组成、极性、pH值和离子强度来达到改变k的目的。梯度洗脱和GC中的程序升温非常类似。17仪器分析课件-11-高效液相色谱法18二、进样系统1、注射器进样

与GC相似优点：价格便宜、操作方便。缺点：进样重现性较差，隔膜垫片使用次数有限，操作压力不能过高，一般应小于10MPa。二、进样系统1、注射器进样192、六通阀进样六通高压微量进样阀可直接用于35~40MPa高压下的进样，由于进样体积由定量管计量，因此进样量准确，重现性好，目前几乎取代了注射器进样。2、六通阀进样203、自动进样器

HPLC还可用自动进样器进行批量进样，操作者只需将样品按顺序装入贮样装置，计算机可自动按预定程序进样。该方法适合于大量样品的分析，节省人力。3、自动进样器21三、分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱管常采用内径为1~6mm、长度为10~50cm、内壁抛光的不锈钢直管制成，柱内装填有高效微粒固定相。色谱柱通常由专门的厂家生产提供。三、分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连22仪器分析课件-11-高效液相色谱法23四、检测系统检测器的作用是将色谱柱中流出的样品组分含量随时间变化的信号转化为易于测量的电信号。四、检测系统检测器的作用是将色谱柱中流出的样241、紫外检测器

使用最广泛的检测器，其作用原理是基于待测组分对特定波长紫外线的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系服从光吸收定律。紫外检测器有固定波长（254nm、280nm）和可变波长（200~800nm）两类。1、紫外检测器25紫外光度检测器具有很高的灵敏度，最小检测浓度可达0.1ng/mL，对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱。紫外光度检测器具有很高的灵敏度，最小检测浓度26局限：不适用于不吸收紫外线的试样，也不能选用对紫外线吸收强烈的溶剂作载液。为了扩大其应用范围和提高选择性，可选用可变波长检测器。局限：不适用于不吸收紫外线的试样，也不能选用对紫外线吸收强烈272、蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器是90年代出现的新型检测器。这种检测器是将流出色谱柱的流动相及组分先引入通载气（常用高纯氮）的蒸发室，在蒸发室和漂移加热管中，流动相蒸发而除去，样品组分则在蒸发室内形成不挥发的微小颗粒，在漂移管末端，此微粒在强光照射下产生光散射，用光电倍增管检测到的散射光与组分的量成正比。此检测器是一种通用型的质量检测器，对所有固体物质（检测时）均有几乎相等的响应，检测限一般为8～10ng，可用于挥发性低于流动相的任何样品组分，但对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低，因此特别适用于无紫外吸收的样品，主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸、维生素及甾体类等化合物，是一种正在迅速发展中的检测器。2、蒸发光散射检测器281-色谱柱；2-喷雾气体；3-蒸发漂移管；4-样品液滴；5-激光光源；6-光二极管检测器7-散射室

图蒸发光散射检测器示意图1-色谱柱；图蒸发光散射检测器示意图293、荧光检测器许多物质，特别是具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光。一般情况下，荧光检测器比紫外光度检测器的灵敏度要高2个数量级，但其线性范围较窄。3、荧光检测器一般情况下，荧光检测器比紫外光304、电导检测器电导检测器属于电化学检测器，是离子色谱法中使用最广泛的检测器。其作用原理是根据物质在某些介质中解离后所产生电导变化来测定解离物质含量。5、示差折光检测器借助连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度的检测器。溶有试样的流动相和纯流动相的折射率之差，表示试样在流动相中的浓度。为通用型检测器，但灵敏度稍低，对载液流速和温度十分敏感，要求有很好的恒温装置。4、电导检测器3111-3液相色谱速率理论HPLC的基本概念及理论基础与GC相似，但它们的流动相不同。二者流动相的性质有明显的差别，液体的扩散系数只有气体的万分之一至十万分之一，液体的粘度比气体大一百倍，而密度为气体的一千倍左右。这些性质的差别将影响组分在色谱两相中的扩散和传质运动，进而明显地影响色谱的分离分析过程，所以在描述两种色谱的速率理论时会有所不同。11-3液相色谱速率理论HPLC的基本概念32吉丁斯（Giddings）和斯奈德（Snyder）等人提出了液相色谱速率理论方程式中：Hed—涡流扩散项

Hid—分子扩散项

Hm—流动相传质阻力项

Hsp—固定相传质阻力项吉丁斯（Giddings）和斯奈德（Snyd331、涡流扩散项每一个符号的含义与GC相同，减小固定相粒度、柱子填充均匀，均有利于提高柱效。2、分子扩散项Cd为填充系数，在一定条件下为常数；Dm为组分在流动相中的扩散系数，它比气相扩散系数小4~5个数量级，Hid项通常可以忽略不计。1、涡流扩散项每一个符号的含义与GC相同，减343、固定相传质阻力项Hsp是由试样分子从流动相进入固定液内进行传质引起的。由上式可知，传质过程取决于固定液的液膜厚度df、试样分子在固定液内的扩散系数Ds、以及与分配比k有关的系数Cs。因此，对由固定相传质所引起的峰展宽，应从改善传质，加快溶质分子在固定相上的解吸过程着手加以解决。3、固定相传质阻力项Hsp是由试样分子从流354、流动相传质阻力项（1）Hmp

流动相流动区域内的传质阻力项当流动相流过色谱柱内的填充物时，处于同一横截面上所有分子的流速并不相同，由于摩擦作用，靠近填充物颗粒的流动相流速比流路中间的稍慢一些，其结果引起板高的变化，导致峰展宽。Hmp与线速度u、固定相粒度dp、以及试样分子在流动相中的扩散系数Dm、与分配比k和柱填充状况有关的系数Cm有关。当柱填料填充均匀紧密时，Cm降低。4、流动相传质阻力项当流动相流过色谱柱内的填36（2）Hsm

流动相滞留区域内的传质阻力项由于固定相的多孔性，会造成某部分流动相滞留在固定相微孔内停滞不动。流动相中的试样分子要与固定相进行质量交换，必须先从流动相扩散到滞留区。若固定相的微孔小而深，传质速度就慢，对峰形扩展影响就大，柱效就低。固定相的粒度愈小，微孔孔径愈大，传质速率就愈快，柱效就高。所以改进固定相结构是提高柱效的有效途径。Csm是一常数，与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数以及分配比k有关。（2）Hsm流动相滞留区域内的传质阻力项375、提高柱效的方法影响板高的主要因素是传质阻力项。（1）采用粒度小而均匀、孔穴较浅的固定相担体，这是提高液相色谱柱柱效最有效的途径。（2）采用低粘度溶剂作流动相，以减少在柱内的流动阻力。（3）适当降低流动相流速。但流速太低会增大分子扩散项和减慢分析速度。（4）适当提高柱温，以降低流动相粘度，增大扩散系数。但柱温过高会降低分离度。在色谱分析过程中，各种因素是互相联系和互相制约的。5、提高柱效的方法38上图为由速率理论方程得到的HPLC（a）和GC（b）的H-u曲线，从图中可以看出，二者曲线的形状十分相似，对应某一流速都有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效最高点；HPLC的板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上，说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多；此外，HPLC的板高最低点对应流速比起GC的流速也小一个数量级。上图为由速率理论方程得到的HPLC（a）和3911-4高效液相色谱法的分类根据分离机理不同，可将高效液相色谱法分为液-液分配色谱法、液-固吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法。一、液-液分配色谱法1、分离原理流动相和固定相都是液体，互不相溶，有一个明显的分界面。试样溶于流动相，进入色谱柱后，试样中的组分在两相间进行分配。达到平衡时，各组分的分配服从分配定律。分离顺序取决于分配系数K的大小，K大的组分，保留值就大，后出柱。HPLC中，流动相的种类和性质对K也有较大影响。根据固定液和流动相的极性不同，可分为正相液-液色谱和反相液-液色谱。11-4高效液相色谱法的分类根据分离机理40（1）正相色谱—固定液极性>流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱固定相：极性，如硅胶、氧化铝、羟基、氨基或氰基键合固定相流动相：非极性基础溶剂，正己烷、环己烷极性调节剂，洗脱极性较强的溶质，氯仿、四氢呋喃、甲醇、乙醇主要用于分离极性较强的化合物（1）正相色谱—固定液极性>流动相极性41（2）反相色谱—固定液极性<流动相极性固定相：以硅胶为基质，在其表面将各种不同疏水基团通过化学键合到硅胶表面的游离羟基上（如在硅胶表面上键合C18烷基的非极性固定相，十八烷基硅烷键合相，ODS）。（2）反相色谱—固定液极性<流动相极性42流动相：水、甲醇、四氢呋喃。通常用水-甲醇作流动相时，样品中极性强的组分先流出，随后是极性较弱的组分。这是目前应用最多最有效的液相色谱法，适于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等非极性或弱极性化合物。流动相：水、甲醇、四氢呋喃。432、液-液分配色谱固定相由担体和固定液组成。早期：固定液机械地涂渍在担体上。现在：新型化学键合固定相。利用特定的化学反应，把各种不同的有机基团以化学键的形式连接到担体表面的游离羟基上而制得的。具备的条件：一是担体表面具有某种活性官能团（如硅胶表面的硅醇基），二是固定液应有与担体表面发生化学反应的官能团。优点：化学稳定性和热稳定性好，固定液不会流失，不变质，选择性好，有利于梯度洗脱，极大改善了固定相的柱效能和分离性能。2、液-液分配色谱固定相44仪器分析课件-11-高效液相色谱法45由于液相色谱中流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。因此在液-液色谱中，只需几种极性不同的固定液即可，其中常用的有β,β′-氧二丙腈、聚乙二醇、十八烷和角鲨烷等。由于液相色谱中流动相参与选择作用，流动相极性463、液-液色谱流动相由洗脱剂和调节剂组成。洗脱剂：将试样溶解和分离。调节剂：调节洗脱剂的极性和强度，以改变组分在柱中的移动速度和分离状态。流动相应具有的条件：对试样有适当的溶解度；与固定相不互溶，不与试样发生反应；与所用的检测器相匹配；粘度应较小，以获得较高柱效；纯度高，毒性小，价格便宜，不污染环境和腐蚀机器。流动相与固定相的极性必须有很大差异，才能减小固定相的溶解度，因此要根据固定相的极性来选择合适的溶剂作流动相，以提高分离效果。4、应用对极性和非极性化合物都能达到满意的分离效果，键合相液-液色谱尤其对同系物有良好的分离性能。3、液-液色谱流动相47二、液-固色谱法茨维特实验即是液-固色谱法，固定相为固体吸附剂，它是根据各组分在固定相上吸附能力的差异来进行分离的。1、分离原理流动相分子进入色谱柱后，便以单分子层形式占据吸附剂表面的活性中心点。当试样中组分分子被溶剂带入色谱柱时，由于吸附剂对溶剂和各组分分子的吸附能力不同，于是各组分分子和溶剂分子在吸附剂表面活性中心发生竞争吸附。如果吸附流动相分子的能力更强，被吸附的组分分子将减少，保留时间短；如果吸附组分分子能力强，被吸附的组分分子将增多，保留时间长。由此可使具有不同吸附能力的组分分子得以分离。二、液-固色谱法茨维特实验即是液-固色谱法，482、液-固色谱固定相

极性吸附剂：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

非极性吸附剂：活性碳。极性吸附剂酸性：硅胶、硅酸镁分离碱性物质，如脂肪胺和芳香胺碱性：氧化铝、氧化镁和聚酰胺等分离酸性物质，如酚、羧酸和吡咯衍射物等2、液-固色谱固定相极性吸附剂酸性：硅胶、硅酸镁分离493、液-固色谱流动相

溶剂的极性是选择流动相的重要依据。选择液-固色谱流动相时，应使其极性与试样极性一致。为了获得合适的溶剂极性，常采用两种或两种以上不同极性的溶剂按一定比例混合后使用，如果样品中各组分的分配比相差较大，则可采用梯度洗脱。4、应用液固色谱法是基于吸附剂对溶剂和各组分分子吸附能力的不同而完成对各组分的分离，具有不同官能团的有机化合物具有不同的吸附性能。因此液固色谱法可实现对不同类型有机化合物的分离分析。此外，当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的几何结构相适应时，也易被吸附。因此，吸附色谱还适宜于分离几何异构体。3、液-固色谱流动相50三、离子交换色谱法1、分离原理离子交换色谱法是以离子交换树脂作为固定相的色谱法。当流动相带着组分离解生成的离子通过固定相时，树脂上具有的可交换的离子基团与具有同号电荷的组分离子进行可逆交换，达到交换平衡。阴阳离子的交换平衡可表示为：阴离子交换：阳离子交换：三、离子交换色谱法1、分离原理阴离子交换：阳离子交换51由于不同物质在溶剂中解离后，对离子交换中心具有不同的亲和力，因此具有不同的平衡常数。平衡常数K值越大，表示组分与离子交换树脂亲和力越强，则该组分在柱中停留时间越长，其保留值也越大；反之，平衡常数K值越小，表示组分与离子交换树脂亲和力越弱，则该组分在柱中停留时间较短，其保留值也较小。由此可见，离子交换色谱是根据组分离子对树脂亲和力的不同而得以分离的。由于不同物质在溶剂中解离后，对离子交换中心具522、离子交换色谱固定相离子交换色谱固定相为离子交换树脂。（1）薄膜型和表层多孔型交换树脂

薄膜型树脂是以薄壳玻璃珠为担体，在其表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂。表面多孔型树脂是在惰性固体核表面上先覆盖一层微球硅胶，然后用机械的方法或化学键合的方法，在微球硅珠上涂上一层很薄的树脂膜。优点：树脂不溶胀，机械强度高、耐压、传质速度快、柱效高。缺点：交换层较薄、柱容量低，使进样量受到限制。2、离子交换色谱固定相53（2）全多孔型离子交换树脂

阳离子交换树脂：离子基荷负电，用于分离阳离子。分为强酸性和弱酸性，如磺酸型-SO3H和羧酸型-COOH。

阴离子交换树脂：离子基荷正电，用于分离阴离子。分为强碱性和弱碱性，如季铵盐型-NR3和氨基型-NH2。优点：柱容量高，对温度的稳定性好。缺点：在水或有机溶剂中发生溶胀，不能承受高压，传质速率慢柱效较低。（2）全多孔型离子交换树脂54树脂分类树脂基质有效pH值范围色谱分析应用强酸型阳离子交换树脂磺化聚苯乙烯1~14阳离子分类分离，无机离子，镧系化合物，维生素B，肽，氨基酸弱酸型阳离子交换树脂羧酸聚甲醛，丙烯酸酯5~14阳离子分类分离，生物化学分离，过渡性元素，氨基酸，有机碱，抗生素强碱型阴离子交换树脂季铵聚苯乙烯0~12阴离子分类分离，卤素，生物碱，维生素B，络合物，脂肪酸弱碱型阴离子交换树脂聚胺聚苯乙烯，酚-甲醛0~9各种金属络阴离子的分类分离，不同价的阴离子氨基酸，维生素表离子交换树脂的类型及应用树脂分类树脂基质有效pH值范围色谱分析应用强酸553、离子交换色谱流动相离子交换色谱一般以各种盐类的缓冲水溶液作流动相，通过调节和改变流动相的pH值、缓冲液的类型（提高用于平衡的反离子）、离子强度以及加入少量有机溶剂、配位剂等方式来改变离子交换剂的选择性，使待测样品达到良好的分离效果。4、应用离子交换色谱主要用来分离离子或可离解的化合物，常用于无机离子和生物物质的分离。3、离子交换色谱流动相56四、离子色谱法机理：通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。积分仪计算机贮液器记录仪泵样品注入分离柱抑制柱电导池离子色谱流程图抑制型离子色谱或称双柱离子色谱：离子交换分离柱，抑制柱，电导检测器，流动相为电解质洗脱液。四、离子色谱法机理：通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高57样品为阴离子（以Br-为例）：流动相为NaOH，样品通过阴离子交换树脂，发生离子的交换和洗脱，高浓度OH-影响低浓度Br-的检测。经抑制柱后，洗脱液（NaOH）已被转变成电导值很小的水，消除了本底电导的影响，提高了所测阴离子电导的检测灵敏度。离子交换树脂：R－OH-+Na+Br-R－Br-+Na+OH-抑制柱：R－H++Na+OH-→R－Na+

+H2O流动相R－H++Na+Br-→R－Na+

+H+Br-试样交换洗脱离子色谱法是水溶液中阴离子分析的最佳方法。样品为阴离子（以Br-为例）：流动相为NaOH，样品通过阴58五、空间排阻色谱法

空间排阻色谱法又称凝胶色谱法：不是根据试样组分与两相之间的相互作用力进行分离，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。固定相:为化学惰性多孔物质—凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大，约为数纳米至数百纳米。凝胶过滤色谱（gelfiltrationchromatography,GFC)：流动相为水溶液，适合于水溶性样品分离凝胶渗透色谱（gelpermeationchromatography,GPC)：流动相为有机溶剂，适合于非水溶性样品分离五、空间排阻色谱法空间排阻色谱法又称凝胶色谱法：591、分离原理

当试样组分进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及凝胶孔孔穴中流过。大的组分分子由于不能进入孔穴而被全部排斥，所以最先流出；小的组分分子由于能渗到所有凝胶孔穴中而形成全渗透，所以最后流出；中等大小的组分分子则可渗透到较大的孔穴中，但受到较小孔穴的排斥，所以介于上述两种组分之间流出。

排阻色谱法的分离是建立在溶质分子尺寸大小的基础上的。而分子尺寸一般随相对分子质量的增大而增大，所以洗脱体积又是试样组分相对质量的函数。1、分离原理排阻色谱法的分离是建立在60图中A点所对应的相对分子质量即为凝胶的排斥极限，凡是比A点对应的相对分子质量大的分子，均被排斥在所有胶孔之外，因而以一个单一的谱峰出现。图中B点所对应的相对分子质量即为凝胶的渗透极限，凡是比B点对应的相对分子质量小的分子都可以完全渗入凝胶孔穴中，因而这些组分也以一个单一的谱峰出现。相对分子质量介于上述两个极限之间的组分，将按相对分子质量不同先后被洗脱，从而得到分离。图中A点所对应的相对分子质量即为凝胶的排斥极612、空间排阻色谱固定相空间排阻色谱法主要用来获得分散性聚合物的相对分子质量分布情况。在选择色谱柱固定相时，应使待分离的试样粒子的相对分子质量落在固定相的分级范围内。

孔径大小和分布是空间排阻色谱固定相最重要的参数。（1）软质凝胶。葡萄糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等，适用于水为流动相。具有较高的分离能力和较大的柱容量。但渗透能力差，承受压力低，只适用于常压下低流速的分离与分析。（2）半硬质凝胶。目前应用最多。强度高，渗透性好，柱效高，但只适用于非极性有机流动相，流速不能太高，也不宜长期在高温条件下使用。（3）硬质凝胶。多孔硅胶、多孔玻璃等。骨架坚硬，强度高，渗透性好，无溶胀性，流动相可为水或非水溶剂，适应于较高流速下工作。2、空间排阻色谱固定相623、空间排阻色谱流动相在空间排阻色谱中，选择流动相不是为了控制分离，而仅仅是作为试样的担体。所以流动相应能溶解试样，能浸润固定相，但不应与试样或固定相发生任何相互作用，即不存在吸附或分配作用。此外，还要求其粘度和毒性低，沸点要比柱温高20~50，能与检测器匹配等。常用的流动相有四氢呋喃、十氢化萘、氯仿、二甲基甲酰胺和水等。4、应用空间排阻色谱主要用来分离分析高聚物和生物大分子。3、空间排阻色谱流动相63适宜分离的物质：气相色谱：在操作温度下能气化而不分解的物质。正相色谱：主要用于分离极性较强的化合物。反相色谱：适于分离非极性或弱极性化合物。液固色谱：可实现对不同类型有机化合物的分离分析，还适宜于分离几何异构体。离子交换色谱：主要用来分离离子或可离解的化合物。离子色谱：水溶液中阴离子分析的最佳方法。空间排阻色谱：用来分离分析高聚物和生物大分子。适宜分离的物质：6411-5高效液相色谱分析方法的建立一、了解样品信息和分析目的样品信息：大概组成、浓度范围、组分物理性质、紫外光谱图分析目的：定性、定量，单组份、多组分分析二、样品的预处理在HPLC中，对大多数样品进行分析时，都需经称重或稀释。一般要求样品溶液尽可能与流动相的组成接近，即最好用流动相溶解或稀释样品。许多样品都存在背景干扰，还有些样品中有损坏色谱柱的成分。通常在分析前，对这些样品进行预处理，如液液萃取、液固萃取、提取、蒸馏等。11-5高效液相色谱分析方法的建立一、了解样品信息和分析65三、选择合适的分析方法HPLC分析中，各种方法都有其自身的特点和应用范围，应根据分离分析目的，试样的性质和量多少，现有设备条件等选择最合适的分离方法。一般可根据试样的相对分子质量大小、溶解度及分子结构等进行分离方法的初步选择。相对分子质量方面：对于相对分子质量较低（小于200），挥发性较好，加热又不易分解的试样气相色谱法相对分子质量在200~2000的试样液-固吸附、液-液分配、离子交换、离子色谱相对分子质量大于2000的试样空间排阻色谱法三、选择合适的分析方法相对分子质量方面：对于相对分子质量较低66对于能溶于水并能离解的试样离子交换色谱法溶于水而不能离解的试样或溶于醇类（甲醇、乙醇）的试样反相液-液色谱法能溶于二氯甲烷或氯仿的试样正相液-液色谱法能溶于烃类（如苯、异辛烷）的试样液-固色谱法对于分子尺寸大小有差别的试样空间排阻色谱法溶解性能方面：对于能溶于水并能离解的试样离子交换色谱法溶于水而不能离解的试67对于异构体的分离液-固吸附色谱法具有不同官能团的化合物、同系物的分离液-液分配色谱法酸碱化合物、离子型化合物或能与其相互作用的化合物（如配位体及有机螯合剂）首先考虑离子色谱法，其次是液-液分配色谱法对于高分子聚合物空间排阻色谱法分子结构方面：对于异构体的分离液-固吸附色谱法具有不同官能团的化合物、同系68表色谱选择分离类型原则表色谱选择分离类型原则69四、样品的检测

紫外检测器是HPLC最常用的检测器，在分析样品时，应首先了解样品的紫外谱图。根据紫外谱图可以选出最佳检测波长。紫外检测器一般只能检测含有共轭不饱和键的化合物。若被测化合物没有足够的紫外生色团，应考虑荧光、示差折光、电化学检测器等。四、样品的检测70五、HPLC操作中的注意事项（1）流动相要保持流动相清洁，必要时应重新蒸馏或过滤。在流动相进入色谱柱之前应脱气和过滤，避免堵塞泵内或污染色谱柱的柱头。（2）样品的净化预处理对于组成未知的复杂样品，若直接进入色谱柱，可能使色谱柱污染而失效。通常在分离柱前加一小段与分离柱填料相同的保护柱，延长色谱柱的使用寿命，但富集在保护柱内的杂质，可能随流动相缓慢流出而污染样品。为此对样品先做适当的净化预处理是必要的。可用经典的柱色谱法，对样品按极性大小作预分离。五、HPLC操作中的注意事项71（3）最大样品量样品量对谱图宽度和保留值有一定的影响，对于长度为25cm的柱子，在一般操作条件下最大允许样品量约为0.1mg。（4）pH值范围

硅胶基体的固定相要求pH=2~8之间，pH值高会引起基体硅胶溶解。（5）系统的压力一般HPLC仪器可承受30~40MPa的压力。但由于长期在高压状态下工作，泵、进样阀、密封垫的寿命将缩短，因此工作压力应小于泵的最大允许压力的50%，最好低于15MPa。应注意随着色谱柱的使用，微粒物质会逐步堵塞柱头而使柱压升高。（6）色谱柱清洗对于色谱柱，要定期用强溶剂进行清洗。（3）最大样品量样品量对谱图宽度和保留值有一定的影响7211-6高效液相色谱定性定量分析方法对色谱柱分离后的组分进行定性定量分析是色谱分析过程中的一个重要环节。上一章所讲的GC的定性定量方法基本上都可以作为HPLC的定性定量方法。一、定性分析1、用已知纯物质或文献数据对照定性2、与其他仪器联用定性3、利用检测器的选择性帮助定性二、定量分析1、归一化法：试样中所有组分均须出峰2、外标法：每次进样量应一致3、内标法：对所选择的内标物应有要求11-6高效液相色谱定性定量分析方法对色73实验三高效液相色谱法的分离实验一、实验目的1、了解高效液相色谱仪的结构。2、掌握高效液相色谱仪的基本操作方法和主要实验条件的选择。3、掌握液相色谱定性定量分析技术。实验三高效液相色谱法的分离实验一、实验目的74二、实验原理在互不相溶的两相——流动相和固定相的体系中，当两相作相对运动时，第三组分（即溶质或吸附质）连续不断地在两相之间进行分配，这种分配过程即为色谱过程。由于流动相、固定相以及溶质混合物性质的不同，在色谱过程中溶质混合物中的各组分表现出不同的色谱行为，从而使各组分彼此相互分离，这就是色谱分析法的实质。二、实验原理75液相色谱由泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，试剂瓶中的流动相被泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。液相色谱由泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪76三、仪器和试剂仪器：ThermoFisherUltimate3000高效液相色谱仪、紫外检测器、C18柱。试剂：甲醇（色谱纯）、超纯水、苯和甲苯（分析纯）。四、实验步骤1、试样的配制。2、开机。3、选择实验条件。4、操作方法。五、数据处理1、色谱流出曲线图。2、计算理论塔板数。

三、仪器和试剂77仪器分析课程到此全部结束感谢同学们的支持仪器分析课程感谢同学们的支持78仪器分析河北工业大学仪器分析河北工业大学第十一章高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography（HPLC）第十一章高效液相色谱法HighPerformance80ThermoFisherUltimate3000高效液相色谱仪ThermoFisherUltimate300081

流动相为液体的色谱称为液相色谱。20世纪70年代初，吉丁斯（J.C.Giddings）将气相色谱速率理论引入到液相色谱，并在速率理论的指导下，对经典液相色谱做了重大改进，发展了高效液相色谱法，目前它已成为现代仪器分析中最重要的分离分析方法之一。流动相为液体的色谱称为液相色谱。8211-1概述一、HPLC的特点与经典的液相色谱法相比，HPLC在技术上采用了高效固定相、高压泵、高灵敏度检测器，提高了柱效，加快了分析速度，实现了自动化检测，其主要特点有：（1）高压为了提高柱效，HPLC固定相颗粒极细，填充十分紧密，载液流经色谱柱时受到的阻力很大，为了较快地通过色谱柱，必须对载液施加15~35MPa、甚至高达50MPa的高压。（2）高速高效液相色谱配备了高压输液设备，且采用短柱，在分析速度上比经典液相色谱法快得多。例如分离氨基酸，用经典色谱法，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，l小时之内即可完成。11-1概述一、HPLC的特点与经典的液相色83（3）高效经典液相色谱的柱效为10~100塔板/米，而HPLC由于使用了高效固定相，其柱效可高达104~106塔板/米；同时，计算机技术的引入也使分离操作和数据处理效率大大提高。（4）高灵敏度

HPLC采用了高灵敏度的检测器，大大提高了检测灵敏度。如荧光检测器最小检测限可低至0.01ng。此外，其进样量也很少，用μL级的样品便可进行全分析。（5）应用范围广既能分析一般化合物，也能分析沸点高、热稳定性差和具有生理活性的物质，还能分析离子型化合物和高聚物。此外，还适宜制备高纯试剂。

HPLC与其他仪器的联用是一个重要的发展方向，如HPLC-MS、HPLC-IR、HPLC-NMR等联用技术。（3）高效经典液相色谱的柱效为10~100塔板/米，84二、HPLC与GC的比较

HPLC与GC的基本概念和理论是基本一致的，但HPLC所用的流动相、固定相、分析对象、仪器设备和操作条件等于GC不同。（1）流动相

GC-载气，对组分和固定相呈惰性，专门用来载送样品，只有固定相能与组分分子作用。而HPLC-载液，对组分分子有一定的亲和作用，能与固定相争夺组分分子，因而增大了分离的选择性。GC载气的种类少，HPLC载液种类多，并可灵活调节其极性、离子强度或pH值，为选择最佳分离条件提供方便。二、HPLC与GC的比较HPLC与GC的基85（2）固定相

GC分离的选择性主要是通过选用不同的固定相来实现，所以GC固定相种类繁多，已有数百种。常用的HPLC固定相仅有十几种，其分离选择性在很大程度上要通过选用不同的流动相来改变。GC一般是选定一种载气，然后通过改变固定相及操作参数（柱温和载气流速）来优化分离，而HPLC则相反。此外，GC固定相粒径较大，70~250μm，HPLC固定相粒径较小，3~30μm，所以HPLC比GC柱效高得多。（2）固定相GC分离的选择性主要是通过选用不同的固定86（3）分析对象

GC的分析对象是在操作温度下能气化而不分解的物质，在已知的有机物中，只有20%能用GC分析；HPLC适合于分子量较大、难气化、不易挥发或热不稳定物质、离子型化合物、高聚物等，有大约80%有机物能用HPLC进行分离分析。（4）分离温度

GC一般在高于室温下分离，最高可达300~400℃；HPLC的分离温度一般为室温或略高于室温。（3）分析对象GC的分析对象是在操作温度下能气化而不87（5）色谱柱

GC柱较长较粗，如填充柱内径2~6mm，长1~10m，毛细管柱内径0.1~0.5mm，长10~100m；HPLC柱较短较细，如常规柱长一般为15~30cm，内径1~6mm。（6）流动相驱动力

GC一般采用高压载气，HPLC常采用高压泵。此外，为了提高分离效能，缩短分析时间，GC常采用程序升温的办法，HPLC采用梯度洗脱方式。（5）色谱柱GC柱较长较粗，如填充柱内径2~6mm，8811-2高效液相色谱仪高效液相色谱仪主要由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测和记录系统四大部分组成。其工作过程为：贮液器中的载液经高压泵输送到色谱管路中，试样由进样器注入流动相，流经色谱柱进行分离，分离后的各组分由检测器检测，输出信号由记录仪记录下来，即得到液相色谱图。11-2高效液相色谱仪高效液相色谱仪主要89高压输液系统进样系统分离系统检测和记录系统高压输液系统进样系统分离系统检测和记录系统90一、高压输液系统1、贮液器贮液器用来贮装载液，一般由玻璃、不锈钢或聚四氟乙烯制成，容量为1~2L。贮液器应带有脱气装置，以便有效脱除溶于载液中的气体，从而避免基线噪声增大和基线不稳的情况发生。一、高压输液系统1、贮液器912、高压泵

HPLC色谱柱柱径较细，固定相颗粒细小，再加上液体粘度较大，因此柱内阻力较大。因此必须用高压泵输送载液，才能达到快速分离的目的。一般要求泵的输出压力为15~50MPa。2、高压泵92高压输液泵根据其排液性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。目前绝大多数高压液相色谱所采用的是往复式柱塞恒流泵。高压输液泵根据其排液性质可分为恒压泵和恒流泵933、梯度洗脱装置

梯度洗脱是将两种或两种以上不同性质，但可以互溶的溶剂，随时间改变而按一定比例混合，以连续改变色谱柱中载液的极性、离子强度或pH值等，从而改变被测组分的保留值，提高分离效率，加快分析速度，使样品中各组分都能在最佳的分离条件下出峰。梯度洗脱特别适合于样品中组分k值范围很宽的复杂样品的分析。内梯度外梯度3、梯度洗脱装置内梯度外梯度94梯度洗脱和GC中的程序升温非常类似。相同点：作用相同，都可以改善复杂样品的分离效果。不同点：GC中的程序升温是通过程序改变柱温，使柱温按一定速率升高；而HPLC中的梯度洗脱是通过改变流动相组成、极性、pH值和离子强度来达到改变k的目的。梯度洗脱和GC中的程序升温非常类似。95仪器分析课件-11-高效液相色谱法96二、进样系统1、注射器进样

与GC相似优点：价格便宜、操作方便。缺点：进样重现性较差，隔膜垫片使用次数有限，操作压力不能过高，一般应小于10MPa。二、进样系统1、注射器进样972、六通阀进样六通高压微量进样阀可直接用于35~40MPa高压下的进样，由于进样体积由定量管计量，因此进样量准确，重现性好，目前几乎取代了注射器进样。2、六通阀进样983、自动进样器

HPLC还可用自动进样器进行批量进样，操作者只需将样品按顺序装入贮样装置，计算机可自动按预定程序进样。该方法适合于大量样品的分析，节省人力。3、自动进样器99三、分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱管常采用内径为1~6mm、长度为10~50cm、内壁抛光的不锈钢直管制成，柱内装填有高效微粒固定相。色谱柱通常由专门的厂家生产提供。三、分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连100仪器分析课件-11-高效液相色谱法101四、检测系统检测器的作用是将色谱柱中流出的样品组分含量随时间变化的信号转化为易于测量的电信号。四、检测系统检测器的作用是将色谱柱中流出的样1021、紫外检测器

使用最广泛的检测器，其作用原理是基于待测组分对特定波长紫外线的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系服从光吸收定律。紫外检测器有固定波长（254nm、280nm）和可变波长（200~800nm）两类。1、紫外检测器103紫外光度检测器具有很高的灵敏度，最小检测浓度可达0.1ng/mL，对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱。紫外光度检测器具有很高的灵敏度，最小检测浓度104局限：不适用于不吸收紫外线的试样，也不能选用对紫外线吸收强烈的溶剂作载液。为了扩大其应用范围和提高选择性，可选用可变波长检测器。局限：不适用于不吸收紫外线的试样，也不能选用对紫外线吸收强烈1052、蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器是90年代出现的新型检测器。这种检测器是将流出色谱柱的流动相及组分先引入通载气（常用高纯氮）的蒸发室，在蒸发室和漂移加热管中，流动相蒸发而除去，样品组分则在蒸发室内形成不挥发的微小颗粒，在漂移管末端，此微粒在强光照射下产生光散射，用光电倍增管检测到的散射光与组分的量成正比。此检测器是一种通用型的质量检测器，对所有固体物质（检测时）均有几乎相等的响应，检测限一般为8～10ng，可用于挥发性低于流动相的任何样品组分，但对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低，因此特别适用于无紫外吸收的样品，主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸、维生素及甾体类等化合物，是一种正在迅速发展中的检测器。2、蒸发光散射检测器1061-色谱柱；2-喷雾气体；3-蒸发漂移管；4-样品液滴；5-激光光源；6-光二极管检测器7-散射室

图蒸发光散射检测器示意图1-色谱柱；图蒸发光散射检测器示意图1073、荧光检测器许多物质，特别是具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光。一般情况下，荧光检测器比紫外光度检测器的灵敏度要高2个数量级，但其线性范围较窄。3、荧光检测器一般情况下，荧光检测器比紫外光1084、电导检测器电导检测器属于电化学检测器，是离子色谱法中使用最广泛的检测器。其作用原理是根据物质在某些介质中解离后所产生电导变化来测定解离物质含量。5、示差折光检测器借助连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度的检测器。溶有试样的流动相和纯流动相的折射率之差，表示试样在流动相中的浓度。为通用型检测器，但灵敏度稍低，对载液流速和温度十分敏感，要求有很好的恒温装置。4、电导检测器10911-3液相色谱速率理论HPLC的基本概念及理论基础与GC相似，但它们的流动相不同。二者流动相的性质有明显的差别，液体的扩散系数只有气体的万分之一至十万分之一，液体的粘度比气体大一百倍，而密度为气体的一千倍左右。这些性质的差别将影响组分在色谱两相中的扩散和传质运动，进而明显地影响色谱的分离分析过程，所以在描述两种色谱的速率理论时会有所不同。11-3液相色谱速率理论HPLC的基本概念110吉丁斯（Giddings）和斯奈德（Snyder）等人提出了液相色谱速率理论方程式中：Hed—涡流扩散项

Hid—分子扩散项

Hm—流动相传质阻力项

Hsp—固定相传质阻力项吉丁斯（Giddings）和斯奈德（Snyd1111、涡流扩散项每一个符号的含义与GC相同，减小固定相粒度、柱子填充均匀，均有利于提高柱效。2、分子扩散项Cd为填充系数，在一定条件下为常数；Dm为组分在流动相中的扩散系数，它比气相扩散系数小4~5个数量级，Hid项通常可以忽略不计。1、涡流扩散项每一个符号的含义与GC相同，减1123、固定相传质阻力项Hsp是由试样分子从流动相进入固定液内进行传质引起的。由上式可知，传质过程取决于固定液的液膜厚度df、试样分子在固定液内的扩散系数Ds、以及与分配比k有关的系数Cs。因此，对由固定相传质所引起的峰展宽，应从改善传质，加快溶质分子在固定相上的解吸过程着手加以解决。3、固定相传质阻力项Hsp是由试样分子从流1134、流动相传质阻力项（1）Hmp

流动相流动区域内的传质阻力项当流动相流过色谱柱内的填充物时，处于同一横截面上所有分子的流速并不相同，由于摩擦作用，靠近填充物颗粒的流动相流速比流路中间的稍慢一些，其结果引起板高的变化，导致峰展宽。Hmp与线速度u、固定相粒度dp、以及试样分子在流动相中的扩散系数Dm、与分配比k和柱填充状况有关的系数Cm有关。当柱填料填充均匀紧密时，Cm降低。4、流动相传质阻力项当流动相流过色谱柱内的填114（2）Hsm

流动相滞留区域内的传质阻力项由于固定相的多孔性，会造成某部分流动相滞留在固定相微孔内停滞不动。流动相中的试样分子要与固定相进行质量交换，必须先从流动相扩散到滞留区。若固定相的微孔小而深，传质速度就慢，对峰形扩展影响就大，柱效就低。固定相的粒度愈小，微孔孔径愈大，传质速率就愈快，柱效就高。所以改进固定相结构是提高柱效的有效途径。Csm是一常数，与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数以及分配比k有关。（2）Hsm流动相滞留区域内的传质阻力项1155、提高柱效的方法影响板高的主要因素是传质阻力项。（1）采用粒度小而均匀、孔穴较浅的固定相担体，这是提高液相色谱柱柱效最有效的途径。（2）采用低粘度溶剂作流动相，以减少在柱内的流动阻力。（3）适当降低流动相流速。但流速太低会增大分子扩散项和减慢分析速度。（4）适当提高柱温，以降低流动相粘度，增大扩散系数。但柱温过高会降低分离度。在色谱分析过程中，各种因素是互相联系和互相制约的。5、提高柱效的方法116上图为由速率理论方程得到的HPLC（a）和GC（b）的H-u曲线，从图中可以看出，二者曲线的形状十分相似，对应某一流速都有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效最高点；HPLC的板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上，说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多；此外，HPLC的板高最低点对应流速比起GC的流速也小一个数量级。上图为由速率理论方程得到的HPLC（a）和11711-4高效液相色谱法的分类根据分离机理不同，可将高效液相色谱法分为液-液分配色谱法、液-固吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法。一、液-液分配色谱法1、分离原理流动相和固定相都是液体，互不相溶，有一个明显的分界面。试样溶于流动相，进入色谱柱后，试样中的组分在两相间进行分配。达到平衡时，各组分的分配服从分配定律。分离顺序取决于分配系数K的大小，K大的组分，保留值就大，后出柱。HPLC中，流动相的种类和性质对K也有较大影响。根据固定液和流动相的极性不同，可分为正相液-液色谱和反相液-液色谱。11-4高效液相色谱法的分类根据分离机理118（1）正相色谱—固定液极性>流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱固定相：极性，如硅胶、氧化铝、羟基、氨基或氰基键合固定相流动相：非极性基础溶剂，正己烷、环己烷极性调节剂，洗脱极性较强的溶质，氯仿、四氢呋喃、甲醇、乙醇主要用于分离极性较强的化合物（1）正相色谱—固定液极性>流动相极性119（2）反相色谱—固定液极性<流动相极性固定相：以硅胶为基质，在其表面将各种不同疏水基团通过化学键合到硅胶表面的游离羟基上（如在硅胶表面上键合C18烷基的非极性固定相，十八烷基硅烷键合相，ODS）。（2）反相色谱—固定液极性<流动相极性120流动相：水、甲醇、四氢呋喃。通常用水-甲醇作流动相时，样品中极性强的组分先流出，随后是极性较弱的组分。这是目前应用最多最有效的液相色谱法，适于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等非极性或弱极性化合物。流动相：水、甲醇、四氢呋喃。1212、液-液分配色谱固定相由担体和固定液组成。早期：固定液机械地涂渍在担体上。现在：新型化学键合固定相。利用特定的化学反应，把各种不同的有机基团以化学键的形式连接到担体表面的游离羟基上而制得的。具备的条件：一是担体表面具有某种活性官能团（如硅胶表面的硅醇基），二是固定液应有与担体表面发生化学反应的官能团。优点：化学稳定性和热稳定性好，固定液不会流失，不变质，选择性好，有利于梯度洗脱，极大改善了固定相的柱效能和分离性能。2、液-液分配色谱固定相122仪器分析课件-11-高效液相色谱法123由于液相色谱中流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。因此在液-液色谱中，只需几种极性不同的固定液即可，其中常用的有β,β′-氧二丙腈、聚乙二醇、十八烷和角鲨烷等。由于液相色谱中流动相参与选择作用，流动相极性1243、液-液色谱流动相由洗脱剂和调节剂组成。洗脱剂：将试样溶解和分离。调节剂：调节洗脱剂的极性和强度，以改变组分在柱中的移动速度和分离状态。流动相应具有的条件：对试样有适当的溶解度；与固定相不互溶，不与试样发生反应；与所用的检测器相匹配；粘度应较小，以获得较高柱效；纯度高，毒性小，价格便宜，不污染环境和腐蚀机器。流动相与固定相的极性必须有很大差异，才能减小固定相的溶解度，因此要根据固定相的极性来选择合适的溶剂作流动相，以提高分离效果。4、应用对极性和非极性化合物都能达到满意的分离效果，键合相液-液色谱尤其对同系物有良好的分离性能。3、液-液色谱流动相125二、液-固色谱法茨维特实验即是液-固色谱法，固定相为固体吸附剂，它是根据各组分在固定相上吸附能力的差异来进行分离的。1、分离原理流动相分子进入色谱柱后，便以单分子层形式占据吸附剂表面的活性中心点。当试样中组分分子被溶剂带入色谱柱时，由于吸附剂对溶剂和各组分分子的吸附能力不同，于是各组分分子和溶剂分子在吸附剂表面活性中心发生竞争吸附。如果吸附流动相分子的能力更强，被吸附的组分分子将减少，保留时间短；如果吸附组分分子能力强，被吸附的组分分子将增多，保留时间长。由此可使具有不同吸附能力的组分分子得以分离。二、液-固色谱法茨维特实验即是液-固色谱法，1262、液-固色谱固定相

极性吸附剂：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

非极性吸附剂：活性碳。极性吸附剂酸性：硅胶、硅酸镁分离碱性物质，如脂肪胺和芳香胺碱性：氧化铝、氧化镁和聚酰胺等分离酸性物质，如酚、羧酸和吡咯衍射物等2、液-固色谱固定相极性吸附剂酸性：硅胶、硅酸镁分离1273、液-固色谱流动相

溶剂的极性是选择流动相的重要依据。选择液-固色谱流动相时，应使其极性与试样极性一致。为了获得合适的溶剂极性，常采用两种或两种以上不同极性的溶剂按一定比例混合后使用，如果样品中各组分的分配比相差较大，则可采用梯度洗脱。4、应用液固色谱法是基于吸附剂对溶剂和各组分分子吸附能力的不同而完成对各组分的分离，具有不同官能团的有机化合物具有不同的吸附性能。因此液固色谱法可实现对不同类型有机化合物的分离分析。此外，当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的几何结构相适应时，也易被吸附。因此，吸附色谱还适宜于分离几何异构体。3、液-固色谱流动相128三、离子交换色谱法1、分离原理离子交换色谱法是以离子交换树脂作为固定相的色谱法。当流动相带着组分离解生成的离子通过固定相时，树脂上具有的可交换的离子基团与具有同号电荷的组分离子进行可逆交换，达到交换平衡。阴阳离子的交换平衡可表示为：阴离子交换：阳离子交换：三、离子交换色谱法1、分离原理阴离子交换：阳离子交换129由于不同物质在溶剂中解离后，对离子交换中心具有不同的亲和力，因此具有不同的平衡常数。平衡常数K值越大，表示组分与离子交换树脂亲和力越强，则该组分在柱中停留时间越长，其保留值也越大；反之，平衡常数K值越小，表示组分与离子交换树脂亲和力越弱，则该组分在柱中停留时间较短，其保留值也较小。由此可见，离子交换色谱是根据组分离子对树脂亲和力的不同而得以分离的。由于不同物质在溶剂中解离后，对离子交换中心具1302、离子交换色谱固定相离子交换色谱固定相为离子交换树脂。（1）薄膜型和表层多孔型交换树脂

薄膜型树脂是以薄壳玻璃珠为担体，在其表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂。表面多孔型树脂是在惰性固体核表面上先覆盖一层微球硅胶，然后用机械的方法或化学键合的方法，在微球硅珠上涂上一层很薄的树脂膜。优点：树脂不溶胀，机械强度高、耐压、传质速度快、柱效高。缺点：交换层较薄、柱容量低，使进样量受到限制。2、离子交换色谱固定相131（2）全多孔型离子交换树脂

阳离子交换树脂：离子基荷负电，用于分离阳离子。分为强酸性和弱酸性，如磺酸型-SO3H和羧酸型-COOH。

阴离子交换树脂：离子基荷正电，用于分离阴离子。分为强碱性和弱碱性，如季铵盐型-NR3和氨基型-NH2。优点：柱容量高，对温度的稳定性好。缺点：在水或有机溶剂中发生溶胀，不能承受高压，传质速率慢柱效较低。（2）全多孔型离子交换树脂132树脂分类树脂基质有效pH值范围色谱分析应用强酸型阳离子交换树脂磺化聚苯乙烯1~14阳离子分类分离，无机离子，镧系化合物，维生素B，肽，氨基酸弱酸型阳离子交换树脂羧酸聚甲醛，丙烯酸酯5~14阳离子分类分离，生物化学分离，过渡性元素，氨基酸，有机碱，抗生素强碱型阴离子交换树脂季铵聚苯乙烯0~12阴离子分类分离，卤素，生物碱，维生素B，络合物，脂肪酸弱碱型阴离子交换树脂聚胺聚苯乙烯，酚-甲醛0~9各种金属络阴离子的分类分离，不同价的阴离子氨基酸，维生素表离子交换树脂的类型及应用树脂分类树脂基质有效pH值范围色谱分析应用强酸1333、离子交换色谱流动相离子交换色谱一般以各种盐类的缓冲水溶液作流动相，通过调节和改变流动相的pH值、缓冲液的类型（提高用于平衡的反离子）、离子强度以及加入少量有机溶剂、配位剂等方式来改变离子交换剂的选择性，使待测样品达到良好的分离效果。4、应用离子交换色谱主要用来分离离子或可离解的化合物，常用于无机离子和生物物质的分离。3、离子交换色谱流动相134四、离子色谱法机理：通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。积分仪计算机贮液器记录仪泵样品注入分离柱抑制柱电导池离子色谱流程图抑制型离子色谱或称双柱离子色谱：离子交换分离柱，抑制柱，电导检测器，流动相为电解质洗脱液。四、离子色谱法机理：通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高135样品为阴离子（以Br-为例）：流动相为NaOH，样品通过阴离子交换树脂，发生离子的交换和洗脱，高浓度OH-影响低浓度Br-的检测。经抑制柱后，洗脱液（NaOH）已被转变成电导值很小的水，消除了本底电导的影响，提高了所测阴离子电导的检测灵敏度。离子交换树脂：R－OH-+Na+Br