实验8植物组织中可溶性蛋白质含量的测定

8皓月创作Ⅰ．斐林-酚试剂法[原理]斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包含两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白650nm100倍。由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的5～l00μg[资料、仪器设备及试剂](二)仪器设备722器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。(三)试剂(1)0．5mol／LNa0H。(2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：A4％碳酸钠(Na2C030.2mol/L(Na0H液等体积混合。B1％硫酸铜(CuS04·5H20)2积混合。使用前将AB50:1天配制。(3(Na2W04H20)100g(Na2Mo04·2H20)25g，700ml1500mL85％的H3PO450mL，浓Hcl100mL，安上回流10h。冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g50ml2-315min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，15min）。待冷却后稀释至1000ml11mol/L5ml1mol/L剂，当溶液突然转红再转灰绿时，即为滴定终点。计算其相当1mol/L在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性稳定，但此实验的瓜只在pH≠10使显色程度减弱。25mg100ml250μg/ml。[实验步调]（一）尺度曲线的绘制18mm×200mm7，1-70mL0.1mL0.2mL、0.4mL0.6mL、0.8mL、1.0mL1mL0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L。5mL30℃10min。0.5mL30℃30min1650nm1cm纵坐标，绘制尺度曲线。0．5g5mLr／min10min，取上清液1．0mL（2～4查尺度曲线，求出样品中的蛋白质含量。[结果计算]样品中蛋白的含量＝(mg／g)式中：C，mL；WF为测定时加样量，mL。'注意事项还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。Ⅱ．考马斯亮蓝G-250染色法[原理]考马斯亮蓝G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变成青色，前者最大光吸收在465nm，后者在59511nm。在一定蛋白质浓度范围内(1～1000μg)，蛋白质与色595nm用于蛋白质的定量测定。考马斯亮蓝G-250，2min1h4[资料、仪器设备及试剂](一)资料小麦叶片及其他植物资料。(二)仪器设备722具塞刻度试管等。(三)试剂尺度蛋白质溶液：100μg／mL25μg，100mL100mL考马斯亮蓝G-250100mgG-25050mL90100mL85％(W／V)的磷酸，再用蒸1L，贮于棕色瓶中。常温下可保管一个月。[实验步调]62-29-15mL考马斯亮蓝G-2505min1cm595nm(二)样品测定1．0mI5mLG-2502min595nm含量。[结果计算]样品中蛋白质的含量＝(mg／g)式中：C、VT、WF、Vs的暗示意义与斐林-酚法相同。Ⅲ．紫外吸收法280nm下具有最大光吸收。由于各种蛋白质中都含有酪氨酸，因此280nm蛋白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比，故可作定量测定。核酸在紫外区(260nm)也有吸收，可通过校正加以消除。[资料、仪器设备及试剂](一)资料．小麦叶片及其他植物资料。(二)仪器设备紫外分光光度计，离心机，刻度移液管。(三)试剂0．1mol/LPH7．0磷酸缓冲液。[实验步调]（一）样品提取与菲林-酚法相同。（二）测定取适量的样品提取液，根据蛋白质浓度，用0.1mol/LpH7.0280nm260nmpH7.0=1.45A280-0.744A260（mg/mL