细胞工程主要技术课件

细胞工程主要技术2动物细胞工程主要技术第一章动物细胞转化（诱变）第二章细胞融合技术第三章哺乳动物克隆技术第四章哺乳动物胚胎培养与移植利用杂交瘤制备单克隆抗体技术干细胞技术3第一章动物细胞的转化（诱变）通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株，我国业已建立了上百个细胞株，为细胞生物学和医学做出了重大贡献。正常组织的初级培养物，在传代培养过程中，细胞的寿命有一定的限度，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限增殖下去。所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而成为具有癌特性的细胞。5（一）物理因子能使培养细胞发生转化的物理因子主要是指一些电离辐射：放射性同位素的射线：60Co、14C、131I、32P、3H……X射线紫外线照射物理致癌剂6（二）化学因子对细胞具有转化作用的化学因子达数千种之多，其中有无机物，也有有机物。无机物：砷、石棉、铬化合物、镍化合物、镉化合物……有机物：苯、联苯胺、杂环烃、煤焦油、黄曲霉素(aflatoxin)、亚硝胺、烟碱(nicotine)……化学致癌剂7（三）生物因子对细胞具有转化作用的生物因子为肿瘤病毒(tumorvirus)，又称致癌病毒(oncogenicvirus)。现已发现有许多种病毒可引起动物或植物发生肿瘤。肿瘤病毒中有DNA病毒，也有RNA病毒。8Rous肉瘤病毒(Roussarcomavirus)：一种RNA病毒，其基因组含有一个癌基因src，编码产物为具有蛋白质激酶活性的pp60src蛋白，可使许多蛋白质磷酸化，通过级联反应，诱发细胞癌变。pp60src蛋白是一种膜蛋白，结合在质膜的内表面，它可催化磷酸根转移到一些蛋白质的酪氨酸残基上，使磷酸化酪氨酸在细胞中的含量提高了10倍。10虽然动物细胞在培养皿、培养瓶、培养板中均可生长，但在体外利用培养罐进行大量培养就不象培养细菌和酵母那样容易，是动物细胞培养的技术难题之一。目前这一问题已经解决，人们在微生物培养用的发酵罐的基础上研制出一种用于哺乳动物细胞培养的反应罐，用以大量培养悬浮细胞（1个振动搅拌器：可以使细胞得到充足的营养和氧气）。转化动物细胞的规模化培养12细胞融合不仅可用于生物学的基础理论研究，而且在生产实践上还有重要的应用价值，如目前在单克隆抗体的制备、核质关系、体细胞的遗传和发育、新品种的培养、免疫作用、疾病的治疗和性状的改良、潜伏病毒的研究等，已取得了显著的成绩。其中最突出的就是在制备单克隆抗体方面的应用！14一、病毒介导的细胞融合技术促融剂：麻疹病毒、副流感病毒、新城鸡瘟病毒、仙台病毒以及其他一些副粘液科的病毒基本原理：病毒被膜中的糖蛋白含有融合蛋白(fusionprotein),既可介导病毒同宿主细胞融合,又可诱导细胞与细胞融合。

操作繁琐；促融效果较好15融合蛋白是副粘病毒的两种包膜糖蛋白之一，其主要功能是引起病毒包膜与靶细胞膜或被感染的靶细胞膜之间发生融合。细胞融合过程需要另一种包膜糖蛋白――血凝素-神经氨酸酶的协助。融合蛋白需要和同源性血凝素-神经氨酸酶共同表达才能显示出融合细胞的活性。16病毒增殖紫外线灭活稀释细胞悬液细胞融合诱导基本操作流程筛选17二、化学介导的细胞融合技术聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)促融剂：基本原理：一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。操作简便；促融效果好18诱导基本操作流程A细胞融合细胞B细胞A/B细胞混合物按一定数量比例混合与细胞混合物充分混匀一定温度、一定时间计数筛选PEG配制：加热溶化，按体积比加入预热至50oC的无血清培养基后混匀，降温至使用温度待用PEG配制PEG(MW1000-4000,40~60%)20三、电击介导的细胞融合技术操作简便、快速/促融效果好/高回收率/对细胞毒性小原理：游离动物细胞或去壁原生质体，在电融合室中，在高频交流电场的作用下，细胞被极化成偶极子，造成细胞间相互连接成点接触状态；然后施加方波脉冲予以刺激，由于电脉冲的瞬间作用，可击破两细胞接触点处的质膜，此时质膜的脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作用，两个点接触细胞逐步发生细胞融合。BioRad电融合仪21动物细胞0.6M甘露醇，0.5mMCaC12·2H2080-300V/cm,0.5-1兆赫兹,30-90秒0.5-1.5KV/cm,幅度脉宽25微秒融合细胞诱导基本操作流程筛选电击液悬浮于融合小室的电极间加入至细胞排列成串电泳效应正弦交变电场施加2-3个脉冲电场施加23激光细胞融合法与其它化学物理方法相比较具有许多优点：（1）能选择任意两个细胞之间进行融合；（2）因仅在两个细胞的接触点照射激光，故作用于细胞的应力和障碍小;（3）可进行非接触、安全且远距离的无菌操作；（4）能适时观察融合过程。24第三章哺乳动物克隆技术（细胞核移植技术）26克隆羊“多莉”诞生后，克隆技术研究立即成为世界各国生物学家竞相开展的生物学高新技术研究。克隆技术之所以一经产生立即引起高度重视，是因为克隆技术不但具有重要的理论意义而且具有良好的应用前景。

为什么要进行动物克隆?例：1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头叫卢辛达的奶牛，年产牛奶30.8

t，创造了世界奶牛产奶量最高的纪录；而一头普通奶牛的产奶量年平均水平仅为3-4

t，如果能用体细胞核移植技术，克隆高产奶牛，就可以大大提高牛奶产量。301938年,德国科学家Spemann最早提出克隆设想。1952年,美国科学家Briggs和King将发育后期的青蛙胚胎细胞核植入青蛙卵中,没有发育。1965年,中国科学家童第周完成了金鱼核移植并获得成功。1981年,Illmensee和Hoppe用小鼠胚胎细胞第一次获得了克隆小鼠，但其实验未能被重复。1984年,丹麦科学家Willadsen用胚胎细胞克隆羊获成功。第一阶段同种胚胎细胞克隆童第周（1902-1979）童第周等(1965)将金鱼囊胚细胞核移植到鳑鮍的去核卵中,获得了少数核质杂种(nucleo-cytoplasmichybrid,NCH)幼鱼321990年,中国科学院发育生物学研究所杜淼获得了克隆兔。随后,中国科学家利用胚胎细胞相继克隆成了羊、猪、牛、小鼠等几种动物。1993年,美国的First用牛内细胞团细胞成功地获得了克隆牛。1997年,中国学者孟励在美国成功获得克隆猴。

至此,国内外动物克隆采用的均为胚胎细胞。331997年，用胚胎细胞获得的克隆猴341964年,Gurdon以爪蟾为材料,最早进行了体细胞核移植的尝试,获得了1.5％的蝌蚪。第二阶段同种体细胞克隆35Dolly的产生1997年,英国罗斯林研究所I.Wilmut等宣布用成年羊乳腺细胞首次获得克隆羊“多莉”。

实验成功的关键：血清饥饿法

使细胞核与去核卵细胞处于细胞周期的同步状态,以利于恢复核的全能性(重编程).381998年，美国夏威夷大学的Yanagimachi等用克隆鼠的卵丘细胞核作供体，获得了克隆再克隆小鼠。1998年，新西兰成功地克隆了奶牛，并克隆了世界上仅存的最后一头珍稀牛。至此，同种体细胞克隆进入成熟阶段。39克隆牛克隆猕猴克隆狗402002年初，我国首批成年体细胞克隆牛的群体诞生41第三阶段异种体细胞克隆

濒危物种数量日益减少，很难提供用于克隆的卵母细胞和代孕受体，促使科学家提出了异种克隆的设想：将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核(遗传物质)卵母细胞中，来得以实现克隆的技术。但此阶段技术还处在实验探究阶段，尚未完全成熟。421998年1月，美国威斯康星大学的科学家们以牛的卵细胞为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎。1998年～1999年，美国人White用珍稀动物盘羊的体细胞核与牛卵结合，我国学者陈大元将大熊猫体细胞核与兔卵结合，均成功克隆出早期胚胎。432000年，欧洲盘羊--奥姆布雷塔被成功克隆，科学家是为了营救目前世界上数目稀少的欧洲盘羊，避免它们从地球上灭绝消失。442003年5月，世界上第一只克隆骡子--格姆在美国诞生452005年8月24日，中国科学院动物研究所陈大元教授领导的团队，国际首例体细胞克隆亚洲黄羊在山东顺利降生（用山羊做受体）。46第二节哺乳动物克隆的技术方法克隆动物主要方法：胚胎分割胚胎细胞核移植体细胞核移植连续细胞核移植47优质动物体细胞的来源动物卵母细胞的成熟培养重构胚胚胎移植克隆动物检测体细胞核移植法克隆动物的基本操作流程卵母细胞核体细胞核核移植体外培养481、动物体细胞的体外培养G0期(细胞周期时相)常规体外培养降低血清使用量细胞分裂停止移核前49卵丘—卵母细胞复合体(COC)用M199洗3次100μl成熟培养液成熟培养液：

M199+10%FCS+10μg/mLPMSG+10μg/mLHCG5%CO2，38.5℃，饱和湿度24h或28～30h观察卵丘扩展情况例:小牛卵母细胞的成熟培养2、卵母细胞的成熟培养50盲吸法荧光法挤压法吸引法蔗糖法3、去核方法51带下注射直接胞质内注射法4、核注射方法透明带应用压电-脉冲设备直接注射法52常规法原核互换两步法孤雌活化协同法化学诱导法5、核移植方法53将数枚重构胚放入100μL的胚胎培养液（CR1-aa）中培养48h后，选择4细胞以上的胚胎移入铺满滋养层细胞的培养液滴中。在120h半换液，148h加入1mg/mL的葡萄糖。以后每隔48h半换液。6、重构胚胎的体外培养小鼠胎儿成纤维细胞547、胚胎移植方法假孕的同步发情的寄母输卵管内移植(移植1～2细胞的受精卵)子宫角移植(移植桑椹胚)55体细胞核卵母细胞重构胚移入同步发情的动物输卵管或子宫内体细胞克隆动物研究路线图体外培养去核胚胎移植移核568、克隆动物的检测方法微卫星图谱法同工酶法57克隆牛“动动”的微卫星检测结果(红色代表标准分子量，蓝色和绿色代表扩增片段)58受胎率低（26.2%）流产率高(53.8%)克隆动物的存活率低（35.7%)常出现早衰现象存在问题59第三节克隆动物的衰老问题克隆羊“多莉”出现了早衰现象，其端粒长度比正常出生的羊短了20%，这与供核羊FinnDorset的6岁年龄直接相关。人类染色体端粒的荧光免疫原位杂交照片601999年，美籍华人杨向中教授第一个报道了克隆动物具有正常长度的端粒和遗传年龄，得出克隆动物不会未老先衰、克隆动物的遗传年龄与供体动物年龄无关的结论。此后，这一结论被美国麻省的ATC公司在克隆牛和美国洛克菲勒大学在克隆鼠的实验中得到证实。61总之，由于细胞衰老的分子机理至今仍未能研究清楚，因此有关克隆动物的衰老问题，目前仍在争论中，还需要进一步的研究来证实。端粒酶结构的模式图解62第四节克隆动物的应用前景克隆动物在畜牧业和医学方面具有极为重要的意义，这不仅表现在理论研究方面，更重要的是其在应用开发方面的实用价值。631.克隆技术能快速培育出大量的优良品种家畜，而用传统的有性生殖方式培育动物良种不但需要花费很长的时间，而且优良性状难以在后代得到控制。克隆动物在畜牧业和医学方面的意义体现在：2.克隆动物的遗传背景完全一致，因而可以避免动物实验的背景干扰，如用在药物检测上，所得结果将更加稳定可靠。643.动物克隆技术可以用来保护濒危动物，用濒危动物的冷冻细胞随时可以克隆出新的成体动物，而无须耗费大量的人力物力。654.克隆动物可为需要组织器官移植的病人提供所需要的组织器官。国外已经开始了这方面的研究，例如科罗拉多大学的研究者用来源于克隆牛胎儿的多巴胺生成细胞，治疗帕金森氏病模型大鼠，已取得一定效果。66治疗性克隆示意图675、动物克隆技术如果与转基因动物技术结合起来将具有更大的发展潜力。转基因动物克隆技术有性繁殖方式需要几代才能获得稳定表达外源基因的转基因动物，而通过转基因克隆动物的方式，很快便可获得新的转基因动物，从而提高转基因动物的生产效率。68中国农业大学的科学家正在利用转基因奶牛生产人类母乳，并希望三年内在超市中销售。692011年8月，荷兰研究人员对山羊进行转基因改造，让羊奶含有与蜘蛛丝一样的蛋白质。利用这种羊奶织成的织物强度是钢铁的10倍，制造防弹皮肤。70治疗性克隆动物模型器官移植濒危动物转基因动物乳腺生物反应器基础研究遗传育种克隆71讨论克隆人什么时候出现？克隆人有没有必要？

？？？72

一位美国专家说过，无论你相信还是怀疑，无论你支持还是反对，“克隆人的潘多拉盒子将被打开”，从那个盒子里跑出来的是惊喜也好，是噩耗也好，人类都只能接受而无法阻止。73第四章

哺乳动物胚胎培养与胚胎移植

74第一节

胚胎培养早在1913年Brachet就尝试对兔囊胚进行体外培养实验，可是由于对各种动物胚胎所需的体外培养液配方不清楚，致使这方面工作在20世纪的上半世纪发展缓慢。1957年，美国学者Whitten找到了能使小鼠早期胚胎在体外生长发育的培养液配方，从而为哺乳动物体外胚胎培养打开了一条通路。75哺乳动物胚胎培养和胚胎移植在现代医学和畜牧业的发展中占有重要地位。近20多年来，世界上许多实验室均做了大量工作，发展迅速。76把受精卵和不同发育时期的早期胚胎取到体外进行培养，不仅是研究胚胎发育机理的重要手段，而且在培育试管婴儿和试管动物方面有着很大的应用价值。哺乳动物胚胎对发育条件要求严格，而且各种动物胚胎所需的营养条件又有所不同，因此无法制定胚胎培养液的通用配方。77体外受精不同时期胚胎的体外发育潜能一定的合成培养液一定的气相条件从已有的实验结果来看，体外胚胎培养有下列几个关键环节：78成熟的卵子在试管内同精子相遇完成受精作用的过程，称为体外受精。获得卵子的方法有多种，如自然排卵、激素诱发超数排卵(superovulation)、从卵巢手术取卵。人工受精率同卵子成熟度关系极大：卵巢中越接近排卵时间的卵子，受精率越高；未成熟或过熟的卵子受精率低下。一、体外受精79人工受精所用的精子必须是获能(capacitation)的，直接排出的精子或从附睾中取出的精子是不能授精的。所谓获能，即精子在雌性生殖管中停留期间，发生了一定的生理、生化和形态变化，从而获得了同卵子结合的能力的过程。在体外，利用卵巢滤泡液、血清、输卵管液、子宫液和人工培养液处理，同样可使精子获能。80表:丙酮酸钠、乳酸钠和BSA对小鼠精子体外受精力的影响培养液成分卵数精子穿入的卵子数（%）基础培养液

+20毫克分子浓度乳酸钠

+1毫克分子浓度丙酮酸钠

+4毫克/毫升BSA*+以上三种成分18224221925833002065143289（0）（9）（30）（65）（88）人工培养液中的丙酮酸钠、乳酸钠和小牛血清白蛋白（BSA）对小鼠精子的获能影响很大。81受精卵和最早期胚胎较难培养。例如，从猪输卵管中收集到的受精卵，90％能发育到2细胞期，但很少超过4细胞期，可是从子宫中收集到的6-8细胞期的胚胎，却有90％的可发育到桑棋胚或囊胚。又如牛受精卵：6％可培养到8-12细胞期；2细胞期胚胎：则有26％可发育到8-12细胞期；8细胞期胚胎：则有51％可发育到桑椹胚。二、不同时期胚胎的体外发育潜能82例如，1956年Whitten最早配制的培养液只能使8细胞期鼠胚发育成囊胚。1957年Whitten发现，如果把培养液中加入乳酸钙，则可使2细胞胚胎发育到囊胚。1967年Whittingham和Biggers又相继发现，小鼠合子在含丙酮酸/乳酸的培养液中很容易分裂到2-细胞期。后来他们证明，丙酮酸和草酰乙酸是第一次卵裂的单一能源，不必要含有乳酸。

83这些差别说明：并非各时期的胚胎发育能力不同，很可能是由于各时期胚胎所需的发育条件不一样。综上所述，在早期胚胎培养时，要牢记“受精卵和最早期胚胎较难培养”的规律，务必要根据所用实验动物的不同选择特定时期的胚胎，以便成功地启动动物的胚胎培养。84各种动物胚胎对培养液成分要求不同。目前常用的培养液有BMOC-3液、Whitten液、Whittingham液、Ham’sF10+20%小牛血清、SOF培养液、PBS+15%小牛血清、TCM-199组织培养液、M12培养液、M16培养液等。三、一定的合成培养液培养液的成分对早期胚胎发育至关重要，不同动物种类及不同发育时期的胚胎对培养液组成成分的要求不同。例如，体外培养的哺乳动物早期胚胎往往存在一个发育阻断（blocksofdevelopment）现象，即从受精卵开始的体外培养很难一直发育到囊胚阶段，而是停留在某一时期，无法向下发育。85每种动物都有比较固定的阻断时期，如小鼠的2-细胞阻断(2-cellblock)，是指小鼠体外培养的受精卵分裂一次成为2-细胞后，便不再继续分裂，而如果从2-细胞晚期开始培养则可以发育到囊胚。其它动物如牛的的阻断时期为8-16细胞时期，猪为4-细胞时期。针对这一现象，人们首先从改变培养液成分入手，分析阻碍发育的原因，结果发现葡萄糖对小鼠胚胎发育有抑制作用，是造成2-细胞阻断的原因。86值得注意的是：葡萄糖虽然抑制小鼠胚胎2-细胞向4-细胞的发育，但葡萄糖对4-细胞以后的胚胎发育又是必需的。于是，Chatot(1988)对BMOC-2培养液进行了改良，形成了目前受精卵体外培养普遍采用的CZB培养液，它是以谷氨酰氨代替葡萄糖，结果90%左右的受精卵发育到4-细胞时期，2-细胞阻断被克服了。87克服体外发育阻断的另一方法为共同培养(co-culture)，是指将胚胎与输卵管上皮细胞或子宫上皮细胞共同培养，以促进胚胎发育。利用共培养技术已使猪、牛、羊等克服了体外发育阻断现象。哺乳动物早期胚胎与输卵管上皮或子宫上皮细胞共同培养系统，也是研究胚泡着床机理的良好手段。88早期胚胎的培养液需配合一定的气相条件。一般用含5％CO2的空气或5％O2和90％N2的混合气体调节pH值。胚胎对培养液pH变化很敏感，pH值超出7.2-7.4的范围，会引起胚胎死亡。磷酸缓冲液系统的酸度较稳定，气相可用空气。进行体外培养的哺乳动物胚胎，一般只是着床前的早期胚胎。胚胎着床后，同母体建立了密切的物质交换关系，对营养条件的要求更加复杂。因此对着床后的胚胎体外培养更加困难。四、一定的气相条件89Y.O.Hsu和L.T.Chen(1983)将受精后3.5d的鼠胚培养到相当于在子宫内正常发育的第10d胚胎，是胚胎体外培养时间最长的。胚胎发育经过了原肠胚、神经胚、体节期等阶段，培养到第10d时发育出了肢芽、眼泡以及肺、肝、胰等器官。这在哺乳动物胚胎完全体外培养的道路上前进了一大步。近年来，国内外均有人实验将小鼠或兔等的胚泡与子宫内膜上皮细胞共培养，建立胚泡着床模型，试图探明哺乳动物胚泡着床的机理。实验中发现孕酮、雌二醇等激素能促进胚泡与子宫内膜上皮细胞之间的粘附率。90第二节

胚胎移植

从一头受孕母畜（供体）的生殖管道中取出受精卵或发育到一定时期的早期胚胎，移植到与供体母畜同步发情的母畜（受体）生殖管道的一定部位，继续发长、发育，长成子畜的技术称为胚胎移植。在人类中，供体妇女和受体妇女在排卵周期同步的情况下，转移受精卵或早期胚胎，在受体妇女的体内继续孕育的技术，亦称为胚胎移植。911890年，英国的WalterHeape成功地进行了家兔的胚胎移植实验，他把4-细胞期的安哥拉家兔胚胎移植到一只交配过的比利时野兔体内，生下了2只安哥拉小兔。该实验的成功，证实了早期胚胎在生理条件一致的受体母兔内正常发育的可能性。此后，学者们又对小鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马等哺乳动物以及人胚进行移植，均取得了成功。据统计，至1980年世界上通过胚胎移植生出的牛已超过2万头。92

胚胎移植技术有着重要的实践意义，目前该行业兴旺发达，取得了显著的经济效益。胚胎移植的应用价值主要表现在：提高良种母畜的繁殖力胚胎分割/胚胎移植1头母畜1次生双胎胚胎性别选择减少精液消耗冻存良种胚胎保护濒危动物试管婴儿试管动物许多细胞工程技术的最终步骤931头母牛（母马）1年生1胎，一生只能生育10头左右的仔畜，可是其卵巢中却含有75,000个生殖细胞，因此绝大