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生物大分子

(biomacromolecule):具有较大的分子量,由简单的小分子排列组成,具有复杂的空间结构形成精确的相互作用系统,构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统.阐明生物大分子复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务.基因芯片技术：将大量探针分子（通常每平方厘米点阵密度高于400）固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子杂交信号的强度，获取样品分子的数量和序列信息.基因:是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位,对于编码蛋白质的结构基因来说，基因是决定一条多肽链的DNA片段。根据其是否具有转录和翻译功能可以把基因分为三类:第一类是编码蛋白质的基因，它具有转录和翻译功能，包括编码酶和结构蛋白的结构基因以及编码阻遏蛋白的调节基因.第二类是只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因.第三类是不转录的基因，它对基因表达起调节控制作用，包括启动基因和操纵基因.基因组：(genome):泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色体（单倍体）DNA。携带生物体全部遗传信息的核酸量。基因组中不同的区域具有不同的功能：有些区域编码蛋白质的结构基因有些区域复制及转录的调控信号有些区域的功能尚不清楚真核生物基因组特点:1.真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因的基因组是双份的（即双倍体,diploid），即有两份同源的基因组.2.真核细胞基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录生成一个mRNA分子，再翻译生成一条多肽链.3.存在重复序列，重复次数可达百万次以上4.基因组中不编码的区域多于编码的区域5.大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的（断裂基因，splitgene）6.基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起始点，而每个复制子的长度较小.高度重复序列(highrepeatedsequence)高度重复序列在基因组中重复频率高，可达百万（106）以上，因此复性速度很快在基因组中所占比例随种属而异，约占10-60％，在人基因组中约占20％。高度重复顺序又按其结构特点分为三种：反向重复序列、卫星DNA、较复杂的重复单位组成的重复顺序（灵长类动物独有）。卫星DNA（satelliteDNA）：由2-10bp组成重复单位，重复单位成串排列而成，由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，因而称为卫星DNA（或随体DNA），

人的卫星DNA可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种。microsatellitemarker又称shorttandemrepeat，（STR），最重要的优点是高度多态性，提供的信息量相对很大；另外可用PCR技术使操作实现自动化。STR的遗传学图距是以cM（厘摩尔根）为单位的，反映基因遗传效应的基因组图。中度重复序列(middlerepeatedsequence):Alu家族、KpnⅠ家族、Hinf家族、rRNA基因、多聚dＴ－dＧ家族、组蛋白基因。多基因家族（multigenefamily）：是指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因。大致可分为两类：一类是基因家族成簇地分布在某一条染色体上，其可同时发挥作用，合成某些蛋白质（如：组蛋白基因家族就成簇地集中在第7号染色体长臂3区2带到3区6带区域内）。另一类是一个基因家族的不同成员成簇地分布不同染色体上，这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋白质（如珠蛋白基因家族）假基因（pseudogene）：在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，这些基因称为假基因，假基因与有功能的基因同源，原来可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或点突变等，使这一基因失去活性，成为无功能基因。超基因（Supergene）：人体基因组中还有几个大的基因簇，也属于中度重复序列的长分散片段。在一个基因簇内含有几百个功能相关的基因，这些基因簇又称为超基因，如人类主要组织相容性抗原复合体HLA和免疫球蛋白重链及轻链基因都属于超基因。可能是由于基因扩增后又经过功能和结构上的轻微改变而产生的，但仍保留了原始基因的结构及功能的完整性。真核生物的结构基因不仅在两侧有非编码区，而且在基因内部也有许多不编码蛋白质的间隔序列（interveningsequences），称为内含子（intron），编码区则称为外显子（exon），内含子与外显子相间排列，转录时一起被转录下来，然后内含子被切掉，外显子连接在一起成为成熟的mRNA作为指导蛋白质合成的模板。基因表达（geneexpression）：DNA分子将其所承载的遗传信息，通过转录生成mRNA,再指导合成蛋白质的过程。可诱导调节：是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。如乳糖操纵子。可阻遏调节：这类基因平时都是开启的，处在生产蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。如色氨酸操纵子。原核基因调控机制的类型与特点：正转录调控（positive）：调节基因的产物是激活蛋白（activator）正控诱导：效应物使激活蛋白处于活性状态。正控阻遏：效应物使激活蛋白处于非活性状态负转录调控（negative）：调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor）。负控诱导：阻遏蛋白与效应物结合，结构基因转录。负控阻遏：阻遏蛋白与效应物结合，结构基因不转录。转录正调控:指调节产物(活化蛋白)结合结构基因上游的顺式作用元件,激活RNA聚合酶对转录的起始。转录负调控:指调节产物(阻遏蛋白)结合操纵基因,阻遏RNA聚合酶对转录的起始。葡萄糖效应（降解物抑制作用）：大肠杆菌生长在既有葡萄糖又有其他糖类(乳糖等)的介质中,只能利用葡萄糖,当葡萄糖耗尽后才能利用其他糖类,即葡萄糖阻断多种操纵子(葡萄糖敏感操纵子)的表达。葡萄糖效应机理：葡萄糖代谢降解物降低细胞内cAMP的浓度,不能与环腺苷酸受体蛋白CRP或称代谢降解物激活蛋白(CAP)形成足够的cAMP-CAP活性复合物以促使RNA聚合酶与启动子的结合,葡萄糖敏感操纵子不能表达.乳糖操纵子包括：启动子（promotor,P）；操纵基因（operator,O）；结构基因（Z、Y、A）：分别编码β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷透过酶、β-半乳糖苷乙酰基转移酶乳糖操纵子调控模型的主要内容：ZYA基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码；该mRNA分子的启动子（P）位于阻遏基因（I）与操纵基因（O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达；操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp）,是阻遏物的结合位点；当阻遏物与操纵基因相结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制；诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因相结合，从而激发lacmRNA的合成。trp操纵子的阻遏系统trpR基因产物称为辅阻遏蛋白（aporepressor），与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵基因结合并关闭trpmRNA转录。效应物是色氨酸，是由trp操纵子所编码的生物合成途径的末端终产物。当培养基色氨酸含量高，它与辅阻遏蛋白结合，与操纵基因结合，阻遏mRNA的转录；当色氨酸不足时，辅阻遏蛋白失去色氨酸并从操纵基因上解离，trp操纵子去阻遏，mRNA开始转录。trp操纵子的弱化系统：弱化子：位于trpE基因的起始密码前162bp的前导区中的123-150位碱基序列。该区的mRNA可形成茎-环结构，有终止的作用。前导肽：在色氨酸操纵子的前导序列中可能存在前导肽，14个氨基酸。在第10和11位上有相邻的两个色氨酸密码子。前导区的序列分析：具有4个分别以1、2、3、4表示的片段，能以两种不同的方式进行碱基配对：1-2、3-4，或2-3配对。3-4配对区正好位于终止密码子的识别区域。形成发夹结构能力强弱：序列1/2>序列2/3>序列3/4转录弱化作用：mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的。前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，这个前导肽的翻译必定对tRNATrp的浓度敏感。弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体的位置细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停顿下来。二组分调控系统（two-componentsystems）：由位于细胞质膜上的传感蛋白（sensorprotein）和位于细胞质内的应答调节蛋白（responseregulatorprotein）组成。半乳糖操纵子（galactoseoperon）：诱导物是半乳糖。特点：调节基因gelR与结构基因和操纵区距离很远；两个启动子；有两个O区。葡萄糖升高，cAMP-CRP下降；葡萄糖下降，cAMP-CRP升高。S1的转录：无葡萄糖，有半乳糖，高浓度的CRP和cAMP。抑制S2的转录。S2的转录：有葡萄糖。一般认为：cAMP-CRP有利于RNA聚合酶-S1区复合物的形成开链构想，从而起始基因转录。同时，由于S1和S2区的核苷酸部分重叠，这一复合物的存在干扰了RNA聚合酶-S2复合物的形成，抑制了S2起始的基因转录。阿拉伯糖操纵子3个结构基因：araB、araA、araD一个复合的启动子区、两个操纵区和一个调节基因araC。AraC蛋白同时具有正、负调节因子的功能。阿拉伯糖是诱导物。AraC蛋白的正、负调节作用AraC蛋白本身是负调节蛋白-阻遏蛋白（Pr）；有阿拉伯糖、cAMP-CRP同时存在，AraC蛋白成为正调节蛋白-激活蛋白（Pi）AraC蛋白的两种异构体：Pr与Pi细菌中的SOS应答与阻遏蛋白LexASOS是细菌DNA受到破坏时，启动的诱导型DNA修复系统。LexA是SOS应答体系的阻遏蛋白。recA基因表达1000个RecA蛋白。DNA严重受损时，RecA蛋白与单链DNA缺口结合，被激活为蛋白酶，切割LexA蛋白使之失活。多启动子调控的操纵子rRNA操纵子(rrnE)：两个启动子P1和P2，P1是强启动子，快速生长时；P2营养缺乏时，弱启动子。核糖体蛋白SI操纵子（rpsA）：四个启动子，P1P2强启动子；P3P4弱启动子。DnaQ蛋白操纵子：DNA聚合酶亚基，校正DNA复制；受RNA聚合酶活性调节；魔斑（magicspot）：鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸(pppGpp)，可在层析谱上检出。细菌缺乏氨基酸时，会大量合成这两种化合物。影响RNA聚合酶与启动子结合。作为警报素，产生应急反应。抑制核糖体和其他大分子的合成，抑制与氨基酸转运无关的系统。活化某些氨基酸操纵子的转录和表达，活化蛋白水解酶等。转录后调控翻译起始的调控稀有密码子对翻译的影响重叠基因对翻译的影响poly(A)对翻译的影响翻译的阻遏魔斑核苷酸水平对翻译的影响基因簇(Genecluster)：许多相关的基因按功能成套组合，同一家族成员有时紧密排列在一起，称为基因簇。真核基因断裂结构的重要特点：外显子-内含子连接区（exon-intronjunction）的高度保守性和特异性碱基序列。GT-AG法则：外显子-内含子连接区序列高度保守：每个内含子5‘端起始的两个碱基都是GT,而3’端的最后两个碱基总是AG。组成型剪切（constitutivesplicing）：剪掉所有的内含子，将所有的外显子按顺序连接成一个完整的成熟mRNA。选择性剪切（alternativesplicing）：通过不同的剪接方式，产生不同的mRNA，并翻译成不同的蛋白质。或转录时选择不同的启动子，或在转录产物上选择不同的poly(A)位点。真核生物DNA水平上的基因表达调控：通过基因组DNA的变化，包括基因丢失、扩增、重排和移位等方式，消除或变换某些基因并改变它们的活性，从而控制基因表达和生物活性的方式。基因扩增：某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象。基因重排：一个基因可以通过从远离其启动子的地方移到距它很近的位点而被启动转录。基因转换：酵母的“交配型转换”现象，通过基因转换改变性别。DNA甲基化与基因活性的调控DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导基因的活化和表达。能引起染色体结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变。引起某些遗传病。完整基因的定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。不但包括编码区，还包括5’和3’端长度不等的特异性序列。真核基因的转录启动子：决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始点和转录频率的关键元件，在转录起始位点（+1）及其上游大约100-200bp内的一组具有独立功能的DNA序列。核心启动子（corepromoter）：保证RNA聚合酶正常起始转录所必需的DNA序列，包括转录起始位点和上游的-25~-30bp处的TATA盒。确定转录起始位点并产生基础水平的转录。上游启动子元件（upstreampromoterelement,UPE）：包括-70bp附近的CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等，能通过TFIID复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。2、转录模板：从转录起始位点到转录终止处的DNA序列。终止位点：3’端存在poly(A)位点，该位点上游15-30bp处有保守序列AATAAA。可能存在共同的转录终止机制。RNA聚合酶Ⅱ：10-12个亚基组成。羧基末端结构域（CTD）RNA聚合酶Ⅱ基础转录所需的蛋白质因子（TFⅡ）：20种以上的蛋白因子，与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物。终止位点：3’端存在poly(A)位点，该位点上游15-30bp处有保守序列AATAAA。可能存在共同的转录终止机制。增强子：指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。通常具有下列特性：增强效应十分明显增强效应与其位置和取向无关。大多为重复序列:(G)TGGA/TA/TA/T(G)。增强效应有严密的组织和细胞特异性。要有启动子才能发挥作用,但没有基因专一性。受外部信号的调控。沉默子(silencer)：某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。沉默子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。反式作用因子DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开放(正调控)或关闭(负调控)。转录复合物分3部分：RNA聚合酶亚基。与转录起始或终止有关的辅助因子，不具基因特异性。与特异调控序列结合的转录因子。DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开放(正调控)或关闭(负调控)。1.反式作用因子中的DNA结合结构域a.螺旋-转折-螺旋(helix-turn-helix,HTH)：至少有两个α螺旋，中间由短侧链氨基酸残基形成“转折”。一个α螺旋负责识别DNA的大沟，另一个与DNA主链骨架非特异性结合。这类HTH蛋白以二聚体形式与DNA结合b.锌指(zincfinger)结构（图7-19）一个α螺旋与一个反向平行β片层的基部以锌原子为中心，通过与一对半胱氨酸和一对组氨酸之间形成配位键相连接，锌指环上突出的赖氨酸、精氨酸参与DNA结合。Cys2/Cys2锌指：Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cysc.碱性-亮氨酸拉链结构(basic-leucinezipper,bZIP)（图7-20，-21）蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在α螺旋的同一个方向出现。两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合形成拉链型二聚体。该二聚体的氨基端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。d.碱性-螺旋-环-螺旋结构(basic-helix/loop/helix,bHLH)羧基端100-200aa形成两个α螺旋被非螺旋的环状结构所隔开；氨基端是碱性区。该类蛋白形成同源或异源二聚体后，通过它们的碱性区与DNA相结合。e.同源域蛋白(homeodomains):分子中含有约60个氨基酸的保守序列，这些序列参与形成了DNA的结合区。C端有螺旋-转角-螺旋（HTH）样结构。2.转录活化结构域:具有转录调控功能的催化区域，常以复合物形式出现，依赖于DNA结合结构域以外的30-100个氨基酸残基完成蛋白质-蛋白质之间的相互作用。a.带负电荷的螺旋结构：一种酸性的螺旋结构，有稳定转录起始复合物的作用。如糖皮质激素受体AP1家族的Jun及GAL4b.富含谷氨酰胺的结构：如SP1、Oct1/2、Jun、AP2、血清应答因子（SRP）等。c.富含脯氨酸的结构：CTF-NF1、Oct1/2、Jun、AP2、SRP等。真核基因转录调控的主要模式：1、蛋白质磷酸化、信号传导及基因表达:蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导调节方式。细胞表面受体与配体分子的高亲和力特异性结合，能诱导受体蛋白构象变化，使胞外信号顺利通过质膜进入细胞内。受体分子活化细胞功能的途径：a.受体本身或受体结合蛋白具有内源酪氨酸激酶活性。b.配体与细胞表面受体结合，通过G蛋白介导的效应系统产生介质，活化丝氨酸/苏氨酸或c.酪氨酸激酶，从而传递信号。d.受配体结合调控的离子通道2、激素及其影响：靶细胞具有专一的激素受体，可与激素形成复合物，导致结构或化学性质的变化，进入细胞核内，并与DNA的特定区域（激素应答元件，HRE）结合，起始或关闭基因的转录。3、热激蛋白诱导的基因表达应答元件（responseelement）：能与某个（类）专一蛋白因子结合，从而控制基因特异表达的DNA上游序列。热休克蛋白（heatshockprotein）：生物在最适温度范围以上，受热诱导合成的一系列蛋白。分为Hsp90、Hso70、小分子Hsp及泛素4个家族。可能具有保护功能并在细胞正常生长和发育中起重要作用。4、金属硫蛋白基因的多重调控RNA的加工成熟(1)rRNA的加工成熟分子内切割：45S前体，核酸酶，成熟的18、28、5.8SrRNA。化学修饰：碱基甲基化（原核），核糖甲基化（真核）。tRNA的加工成熟可能先生成前体tRNA，核苷修饰，生成4.5S前体tRNA,再剪接成4S成熟tRNA。(2)mRNA的加工成熟：先转录成核不均一RNA(hnRNA)5’’端加”帽子”；3’’端加上poly(A)；剪接；核苷酸的甲基化。(3)真核基因转录后加工的多样性简单转录单位：只编码产生一个多肽，其原始转录产物有时需要加工，有时则不需要加工。无内含子，无poly(A)，有一个保守的回文序列作为转录终止信号。如组蛋白基因。无内含子，需加poly(A)，如腺病毒蛋白IX，α-干扰素和许多酵母蛋白。有内含子，需剪接，需加poly(A)，只产生一个有功能的mRNA。如α和β-珠蛋白基因。2.翻译水平的调控涉及蛋白质合成的4种成分：核糖体mRNA可溶性蛋白因子tRNAKozak提出的真核生物蛋白质合成的“扫描模式”：40S核糖体亚基及有关合成起始因子首先与mRNA模板5’端处结合，然后向3’方向滑行，发现AUG起始密码子时，与60S大亚基结合形成80S起始复合物。mRNA5’端第一个AUG序列大部分都是A/GNNAUGG基因融合现象：协调各种不同蛋白质生物合成。可溶性蛋白因子的修饰与翻译起始调控(1)eIF-2磷酸化对翻译起始的影响：eIF-2的α亚基磷酸化，与eIF-2B紧密结合，直接影响了eIF-2的再利用，从而影响了蛋白质合成起始复合物的生成。(2)CBPII活性与翻译的起始：帽子结合蛋白（CBP）：能识别mRNA上的帽子，促使起始复合物形成。基因的分子生物学定义：DNA分子中含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）。还包括为保证转录所必需的调控序列、5′非翻译序列、内含子以及3′非翻译序列等所有的核酸序列（蛋白质基因和RNA基因）细菌染色体基因组结构的特点1.形成类核（nucleoid）：由一条环状双链DNA分子组成细菌的染色体，并相对聚集在一起，形成一个较为致密的区域。类核无核膜与胞浆分开，类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成，外围是双链闭环的DNA超螺旋2.染色体DNA通常与细胞膜相连：连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异。在DNA链上，与DNA复制、转录有关的信号区域与细胞膜优先结合3.具有操纵子结构：结构基因为多顺反子，若干个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节，数个操纵子还可以由一个共同的调节基因（regulatorygene）即调节子（regulon）所调控4.结构基因都是单拷贝，rRNA基因为多拷贝，基因组DNA中不编码的部份所占比例比真核细胞基因组少得多,比病毒基因组多。5.不出现基因重叠现象：基因组中，编码顺序一般不会重叠。6、具有相同的基因（isogene）:编码同功酶（isoenzyme）7.DNA分子中具有各种功能的识别区域：这些区域往往具有特殊的顺序，并且含有反向重复顺序8.具有终止子（termintor）：基因或操纵子终末的特殊顺序，可使转录终止、RNA聚合酶从DNA链上脱落，终止子有强、弱之分。强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT结构，无需终止蛋白参与即可使转录终止。弱终止子也有反向重复序列，但无polyT结构，需要有终止蛋白（Rho因子）参与才能使转录终止。9、结构基因中无内含子：基因序列是连续的，因此在转录时不需要剪接加工，与真核生物不同。病毒基因组的结构特点：病毒基因组很小，且大小相差较大。病毒基因组可以由DNA组成，或由RNA组成。多数RNA病毒的基因组是由连续的RNA链组成。基因重叠：即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子基因组的大部分可编码蛋白质，只有非常小的一部份不编码蛋白质。形成多顺反子结构（polycistronie）：病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位，形成一个功能单位或转录单元。多顺反子可被一起转录成为含有多个mRNA的分子，称为多顺反子mRNA，然后再加工成各种蛋白质的模板mRNA。除了逆转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次。逆转录病毒基因组有两个拷贝。噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的，而真核细胞病毒的基因是不连续的。有些真核病毒的内含子或其中的一部分，对某一个基因来说是内含子，而对另一个基因却是外显子（exon）。回文结构（palindrome）：又称回文对称结构TTGGCGGNNGCN’N’CCGCCAA、AACCGCCN’N’CGNNGGCGGTT-DNA序列中以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同的双螺旋结构。即对称轴一侧的片段旋转180°后，与另一侧片段对称重复。HIV感染过程：捆绑――当HIV病毒的gp120蛋白捆绑到T-helper细胞的CD4蛋白时，HIV病毒附着到机体的免疫细胞上。滤过性病毒核进入到T-helper细胞内部，并且病毒体的隔膜融合进细胞壁。逆转录――滤过性病毒酶，即逆转录酶，将病毒的RNA转化为DNA；集成――新产生的DNA被病毒整合酶运送到细胞核中，并嵌入到细胞的DNA。HIV病毒被称之为前病毒；复制――细胞核中的病毒DNA利用细胞自己的酶分裂产生信使RNA（mRNA）。mRNA含有制造新的病毒蛋白的指令序列；翻译――mRNA由细胞的酶运送出细胞核。然后病毒就利用自然蛋白生成机制来生成病毒蛋白和酶的长链分子；组装――RNA和病毒酶在细胞边缘聚集。一种被称之为蛋白酶的酶将多肽切成病毒蛋白。发育――新的HIV病毒粒子从细胞壁中收缩出来并打破环绕他们的细胞壁。这就是封装的病毒从细胞中分离出来的过程。基因结构组为RNA双分子，与其它逆转录病毒基本相同。5’端有帽子结构，3’端有poly(A)结构与HBV基因组复制有关的序列1.短链顺向复制序列（DR1和DR2）

2.U5样序列（因与反转录病毒末端的U5序列类似而得名）DR1和U5位于前-C的ORF中，是合成DNA长链的起始部位。DR2位于聚合酶基因与X基因重叠处，是DNA短链合成的起始部位。与HBV基因表达有关的信号序列[1]启动子（promoter，PRO）[2]增强子（enhancer，ENH）[3]polyA附加信号[4]皮质激素敏感因子（GRE）。是与激素受体结合的DNA片段，结合后能使某一已知基因转录水平增加。GRE具有增强子特征[1]顺式作用元件[2]在转录的两个方向均有作用[3]在距其调节的基因不同距离处均可起作用HBVDNA复制过程：以“-”链DNA为模板合成全长的“+”链RNA（称为前基因组RNA）。2.该“+”链RNA被包装在未成熟的核心样颗粒中，同时还有DNA聚合酶和一种蛋白质也被包装在颗粒中。3.在该颗粒中，再以“+”链RNA为模板由逆转录酶催化合成子代“-”链DNA。4.“+”链DNA的合成便以该“-”链DNA为模板和一段RNA为引物而聚合延伸，核心样病毒颗粒在这过程中也成为成熟的病毒颗粒。这时，“+”链DNA仍没有合成完毕，因而造成病毒基因组两条DNA链长度不一样。人类染色体的主要化学成分：DNA、RNA、蛋白质蛋白质：1、组蛋白：赖氨酸、精氨酸2、非组蛋白功能：（1）参与并调控基因表达a.参与基因复制、转录及核酸修饰的酶类（如各种DNA和RNA聚合酶等）就是一类重要的非组蛋白b.参与转录调控的蛋白质(2)维持染色体的高级结构:非组蛋白中的核基质蛋白对于维持染色体的高级结构是必不可少的。线粒体基因组:共含37个基因:H链编码28个、L链编码9个有13个可转录为mRNA，并在线粒体核糖体上翻译为多肽，参与组成氧化磷酸化系统有22个编码tRNA、有2个编码rRNA不含有内含子，大多彼此相接，甚至部分重叠。唯一一个有意义的非编码区是替代环（displacementloop），与三链DNA结构形成相关，含有H链和L链转录的主要启动子自私DNA（selfishDNA）：在哺乳动物包括人体基因组中，存在着大量的非编码顺序。这些顺序中，只有很小一部份具有重要的调节功能，绝大部部分都没有什么特殊功用。在这些DNA序列中虽然积累了大量缺失，重复或其他突变，但对生物并没有什么影响，它们的功能似乎只是自身复制，所以人们称这类DNA为自私DNA或寄生DNA（parasiteDNA）。自私DNA也许有重要的功能，但目前我们还不了解。常用的DNA标记1、限制性酶切片段长度多态性（RFLP）：2、简单序列长度多态性SSLP（simplesequencelengthpolymorphism）小卫星（minisatellite）也称为可变数目的串联重复（variablenumberoftandemrepeat，VNTR）。重复单位长度为几十个核苷酸。微卫星或简单串联重复（simpletandemrepeat，STR）它的重复单位长度短得多，通常为二、三或四核苷酸单位。3、SNP（singlenucleotidepolymorphism）SNP作图的一般步骤包括：①获取DNA序列；②从DNA序列确定序列标签位点（sequencetaggedsites，STSs）；③扫描STSs或ESTs确定候选SNPs；④确定SNPs；⑤将SNPs定位于染色体特定位置。癌基因(oncogene)：细胞内控制细胞生长和分化的基因，它的结构异常或表达异常，可以引起细胞癌变。病毒癌基因(virusoncogene,v-onc)：存在于病毒基因组中的癌基因，它不编码病毒的结构成分，对病毒复制也没有作用，但可以使宿主细胞持续增殖。原癌基因(proto-oncogenes,pro-onc)：存在于生物正常细胞基因组中的癌基因。在正常情况下的表达有时间、空间限制，表达产物参与细胞分化、增殖，未激活的细胞癌基因，促进正常细胞生长、增殖、分化、发育等。原癌基因的产物：（一）细胞外生长因子sisP28（二）跨膜的生长因子受体c-src、c-abl、c-mos、c-raf（三）细胞内信号传导体c-src、c-abl、c-ras、c-mas、H-ras、K-ras、N-ras、crk（四）核内转录因子myc、fos癌基因家族：src家族、ras家族、myc家族、sis家族、erb家族、myb家族原癌基因的激活机理：1.DNA重排：a.插入具有高活性的启动子或增强子(内源性或外源性)，使原癌基因持久、过量地表达。染色体易位是原癌基因DNA重排的典型例子b.负调控区的失活或丢失2.基因放大：基因扩增，可导致基因过量表达。原癌基因扩增一般认为与恶性演进有关，未必是恶性早期的改变3.点突变4.其它调控的异常：反式（Trans）调控系统、转录后的调控异常ras癌基因：参与细胞生长和分化的调控、参与多种肿瘤的形成与发展与人类肿瘤相关的特征性基因有：H-ras、K-ras、N-ras抑癌基因（tumorsuppressorgene）：细胞内一类抑制肿瘤发生、生长的基因，最近又发展为指能对抗癌基因作用的基因。在生物体内与癌基因功能相抵抗，共同保持生物体内正负信号相互作用的相对稳定。肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活都是癌化过程的一部分抑癌基因主要功能：(1)诱导终末分化、(2)维持基因稳定、(3)触发衰老，诱导细胞程序性死亡、(4)调节细胞生长、(5)抑制蛋白激酶活性、(6)改变DNA甲基化酶活性、(7)调节组织蛋白酶活性、(8)调节血管形成、(9)促进细胞间联系原癌基因与肿瘤抑制基因的比较特点原癌基因肿瘤抑制基因基因属性正常生长和增殖必须增殖负调控，分化必须遗传损伤点突变、基因融合、基因扩增点突变、基因缺失、杂合性丢失致癌方式显性突变、杂合子致癌隐性突变，纯合子或半合子致癌遗传方式体细胞突变，不遗传体细胞或种质细胞突变，可遗传多见癌种白血病、淋巴瘤实体瘤1．癌基因与抗癌基因的相对意义：同一种癌基因及其产物在不同细胞中可起完全相反的作用2.促进和抑制生长物质的双重性3．肿瘤是一种异常生长生物技术四大支柱：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程基因工程(GeneticEngineering)的基本定义(狭义)：是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状供体、受体和载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体而言，来自供体的基因属于外源基因。基因工程的基本定义(广义)：为DNA重组技术的产业化设计与应用。包括上游技术和下游技术。上游技术（upstream）指的是外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（即狭义的基因工程），下游技术（downstream）则涉及到含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。基因工程的基本过程:（1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称“切”）；（2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子（简称“接”）；（3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称“转”）；（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称“增”）（5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞（简称“检”）；在重组DNA技术中，对DNA进行切割、合成、剪接、补平、连接和修饰等工具酶是必不可少的。常用的工具

酶主要有：1、限制性核酸内切酶(其中Ⅱ型被称为基因工程的分子手术刀，是分子克隆技术中最重要的工具酶。)2、DNA聚合酶3、DNA连接酶4、碱性磷酸酶5、T4多核苷酸激酶6、核酸酶S1Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用:识别双链DNA特异的4∼6个碱基对，并在此序列内特异切割DNA。根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA分子。粘性末端（stickyend）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。平末端（bluntend）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。同工异源酶（isoschizomers）:来源不同，但能识别和切割同一位点的酶称为。同尾酶（isoaudamers）:识别序列不同，但可产生相同粘性末端的限制酶称为。DNA聚合酶Ⅰ有3种酶活性：①5′→3′DNA聚合酶活性：在引物的存在下，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的5′→3′聚合作用②3′→5′核酸外切酶活性：的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸③5′→3′核酸外切酶活性：切除修复作用。从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸冈崎片段(okazakifragment)：DNA复制是半保留复制，复制是从一个复制起点双向进行的。DNA合成相对于模板链总是按5'-3'，方向进行。复制叉是由一条前导链和一条滞后链组成的。；前导链中DNA合成可连续进行，而在滞后链中是先合成一些不连续的短的片段即岗崎片段。Klenow片段的主要用途：①补齐双链DNA的3′末端，同时可使3′末端DNA标记同位素。②cDNA克隆中，合成cDNA第二链。③DNA序列分析TaqDNA聚合酶具有5′→3′聚合酶活性和依赖于聚合作用的5′→3′外切酶活性逆转录酶（reversetranscriptase）是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。逆转录酶是多功能酶：①RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）、②核糖核酸酶H活性（RNaseH）:3’→5’RNA外切酶活性、③依赖DNA的DNA聚合酶活性（DDDP）末端脱氧核苷酰转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT，简称末端转移酶）（1）底物是单链DNA或有3′突出末端的双链DNA，需要Mg2+（2）底物是平端或3′凹端的双链DNA，需要Co2+在载体或目的基因3′末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接，用于DNA3′末端的同位素探针标记DNA连接酶（DNAligase）主要功能：催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5′磷酸基团与3′羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来，实现DNA体外重组。碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5′-磷酸基团。主要用途：①除去DNA片段上的5′磷酸以防自身连接②在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，从RNA或DNA上除去5′端的磷酸核酸酶S1：可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分其主要作用：①除去的粘性末端以产生平末端②除去cDNA合成时形成的发夹结构③分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况载体（vector）:指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA，包括克隆载体和表达载体。制备的目的基因或外源性DNA片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。特征：①能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般<10Kb。②带有遗传筛选标记。③有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。多克隆位点（multiplecloningsites，MCS）：载体上具有多个限制性内切酶的单一位点（即在载体的其它部位无这些酶的相同位点），以供外源DNA插入。克隆载体：能将载体外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体质粒（plasmid）是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息质粒克隆载体的主要用途：①用于保存和扩增<2Kb目的DNA②构建cDNA文库③目的DNA的测序④作为核酸杂交时的探针来源表达载体：是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。表达系统调控元件：启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号启动子（promoter）：是一段位于结构基因5‘端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性。转录单元(transcriptionunit)：一段从启动子开始至终止子(terminator)结束的DNA序列。RNA聚合酶从转录起点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA链。在细菌中，一个转录单元可以是一个基因，也可以是几个基因。终止子：一个基因的3′末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能，此序列称为终止子。该序列含有一段富含A/T和富含G/C的回文对称结构，终止子转录后形成的RNA具有茎环状局部二级结构。真核表达载体的真核表达元件有：启动子/增强子—克隆位点—终止位点和加polyA信号分子克隆的基本步骤：一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取（二）逆转录法：本法是应用得最多的获取目的基因的方法。（三）人工合成DNA片段：适用于合成分子量较小的目的基因（四）直接从染色体DNA中分离目的基因：适用于制备原核生物目的基因基因组文库（genomiclibrary，G-文库）是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群C-文库：以细胞全部mRNA经逆转录，制备出全套cDNA建库。二、载体的选择：λ噬菌体和粘性质粒载体：常用来构建基因组文库pUC系列等：构建cDNA文库和克隆较小DNA片段M13噬菌体：用于克隆一些待测的DNA序列三、目的基因和载体酶切与连接(一)粘性末端连接：本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点。(二)平末端连接：1．质粒和目的基因上没有相同的酶切位点2．人工接头3.通过同聚尾连接（本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点）四、重组DNA导入受体细胞感受态细胞(competentcell)：细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞。五、重组体的筛选和鉴定遗传标记表型特征筛选：1．抗生素抗性标记筛选2．双抗生素筛选法3．β-半乳糖苷酶基因失活筛选（蓝白斑筛选）4．营养标记选择重组子结构特征的筛选：1．酶切鉴定2．PCR筛选法3．核酸杂交技术筛选基因工程的基本原理（1）利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高其宏观表达水平（2）筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转录调控原件，并将这些原件与外源基因精细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平（3）选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控原件，强化受体细胞中蛋白的生物合成过程（4）基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生产效能的基础上，从工程菌（细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反应器的增值速度和最终数量，也是提高外源表达产物产量的主要环节基因诊断（genediagnostics）:对疾病或与致病相关的核酸片段（DNA或RNA）的确定及核苷酸序列的测定(狭义)。对疾病或与致病相关的基因（DNA）的表达产物（mRNA、蛋白质）的确定和序列测定，即从疾病基因或与致病相关的基因及其表达产物的水平上进行检测，因此实现了疾病的早期诊断。常见的基因诊断技术：限制性核酸内切酶酶谱分析、限制酶片段长度多态性（RFLP）连锁分析、核酸分子杂交（hybridization）、聚合酶链反应（PCR）、DNA测序技术、DHPLC技术、DNA芯片技术分子杂交（简称杂交，hybridization）：两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交（molecularhybridization）是核酸研究中一项最基本的基因诊断技术。杂交的基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子（heteroduplex）。杂交双链可以在DNA与DNA链之间形成，也可在RNA与DNA链之间形成。融解温度(melting-temperature，Tm)：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度。由于这一现象和结晶的融解过程相似，又称为融解温度核酸分子杂交技术类型Southern印迹杂交：检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子。将DNA经限制性内切酶酶切，凝胶电泳变性后，转移至膜上与标记探针进行杂交。Northern印迹杂交：检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子。斑点杂交（Dot-blot）：检测固定在膜上的DNA或RNA分子。将DNA或RNA变性后直接点样吸附于硝酸纤维素膜上，然后用标记探针进行杂交。原位杂交（Insituhybridization）：检测细胞或组织中的DNA或RNA分子。是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法（allelespecificoligonucleotide,ASO）：通过位于寡核苷酸探

针中部的基因（或序列）特异性碱基与靶序列DNA的碱基配对和严格条件下洗膜来达到检测基因中少数碱基变化（少至单个碱基）的目的。ASO可结合PCR，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）:又称体外酶促基因扩增。是体外模拟DNA的复制。（它是模拟DNA体内复制过程，在DNA聚合酶作用下，进行特DNA片段的体外复制）。原理和方法条件：1.高温变性：将反应体系加热到90度以上，1条双链模板变成2条单链模板。90～95℃变性2.低温退火（复性）：将反应体系降温到50度左右，人工合成的特异寡核苷酸引物，按照碱基配对原则，与单链模板DNA结合。40～60℃退火3.中温延伸：在耐热DNA聚合酶作用下，在引物引导下，逐一将人工合成的dNTP连接上去，一条单链形成双链。70～75℃延伸PCR反应五要素（一）模板（template）（二）引物（primers）每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol（三）DNA聚合酶（DNApolymerase）2.5U（指总反应体积为100ul时）（四）dNTP，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)（五）PCR缓冲液（PCRbuffer）Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜PCR扩增产物的检测方法(一)凝胶电泳1．琼脂糖凝胶电泳法：用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广。可以用于DNA分子量的测定、DNA的制备与纯化2．聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE电泳）：用于小片段DNA的分析，精度非常高。可用于PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）PCR-限制性片段长度多态性分析法（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）：不同的限制性核酸内切酶有具识别的特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息。基因芯片（Genechip）：通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面作为探针，荧光标记的样品DNA/RNA借助碱基互补作用与探针进行杂交，从而进行大量的基因表达及监测等方面的研究基因治疗（genetherapy）:将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，达到治疗疾病目的的方法。都可称为基因治疗。基因治疗的主要内容:1、基因标记(genelabeling):将含有neo基因的重组逆转录病毒载体在体外转染细胞，然后输入体内.便于追踪，以获得进一步临床治疗的有用信息.2、基因置换（genereplacement）:又称基因矫正（genecorrecting)，指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因取代基因组内有缺陷的基因，不涉及基因组其它改变。必要条件：①导入基因及其产物有详尽了解；②导入基因有适度表达；③基因导入的方法与所用载体对宿主安全无害3、基因添加（geneaugmentation）：是导入外源基因使靶细胞表达本身不表达的基因。4、基因干预(geneinterference)：指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因使之不表达，以达到治疗的目的。最常用的方法是采用RNAi或加核酶。5、基因疫苗（genevaccine）：将编码某种蛋白抗原的基因插入质粒载体，直接导入机体，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原的免疫应答。必要条件:1、发病机制在DNA水平上已经清楚2、要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解3、该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作三个核心：1、基因载体系统2、基因表达系统3、治疗基因RNA干扰（RNAinterference，RNAi）：RNA被摄入细胞后，可特异性高效率抑制与其同源的靶基因的表达，这一现象称RNA干扰。siRNA（smallRNAinterference）：原理是利用双链小片段RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。作用机制：双链RNA+Dicer酶=siRNA（21～25个核苷酸的小片段双链RNA），si