基因工程概论3

第一章绪论第一节基因工程诞生的理论基础一.确定了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质。明确了遗传的物质基础问题

1.肺炎双球菌转化实验1944年Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。

2.噬菌体转染实验1952年AlfredHershy和MarshaChase进一步证明遗传物质是DNA二.揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。

1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。三.提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题

1958年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等终于破译了64个遗传密码

F.Jacob和J.Monod在1961年提出了操纵子学说第二节基因工程诞生的技术基础DNA分子的体外切割与连接1.限制性内切酶（restrictionenzymes）

WernerArber理论预见限制酶

1968年H.O.Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶

DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断

3人于1978年获得Nobel生理或医学奖2.DNA连接酶（ligase）

1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶二.DNA分子的核苷酸序列分析

1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert发明了DNA快速测序技术,1980年Nobel化学奖三.载体的构建

1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增四.转化技术

1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S.Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA五.琼脂糖凝胶电泳和southern转移杂交技术

1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开;DNA印迹技术由Southern于1975创建,称为Southern印迹技术第三节基因工程发展史上的某些重要事件1869年，F.Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到DNA1944年，等人在肺炎链球菌转化实验中发现遗传信息的携带者是DNA，而不是蛋白质

1952年，

A.D.Hershey和M.Chase再次证明T2噬菌体的遗传物质是DNA1953年，和F.H.C.Crick提出双螺旋结构模型

1958年,Meselson米西尔森和Stanl斯坦尔提出了DNA半保留复制模型

1961年，马太(Matthaei)和尼伦伯格(Nirenberg)破译了第一批密码子，F.Jacob和J.Monod提出了操纵子模型

1962年，Arber等人发现限制性内切酶1968年,

Smith和wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性内切酶HindIII

1967-1968年，发现了DNA连接酶，建立了DNA序列分析方法

1972年，得到了第一个重组的DNA分子

1973年，完成了第一个细菌基因的克隆

1974年，首次实现了异源真核生物的基因在大肠杆菌中的转化

1978年，用大肠杆菌表达人工合成的人脑激素和人胰岛素

1981年，成功获得了第一个转基因小鼠，培育出转基因果蝇

1982年，第第一个个由基基因工工程菌菌生产产的药药物:胰岛素素1983年，第第一个个转基基因植植物培培育成成功1986年，基基因工工程生生物在在控制制的情情况下下，实实验性性地释释放到到环境境中1988年，开开始人人类基基因计计划1994年，基基因工工程西西红柿柿在美美国上上市2000年，人人和拟拟南芥芥测序序完成成2006年，水水稻稻基因因组测测序完完成第四节节基基因工工程的的定义义及其其主要要的研研究内内容一.基因工工程的的诞生生1.Berg的开创创性实实验1972年斯坦坦福大大学的的PaulBerg小组完完成了了首次次体外外重组组实验验：将SV40的DNA片断与与噬菌体体的DNA片断连连接起起来(用DNA末端转转移酶酶，而而非限限制性性内切切酶)。2.Boyer-Cohen实验1973年斯坦坦福大大学的的S.Cohen小组将将含有有卡那霉霉素抗抗性基因的的大肠肠杆菌菌R6-5质粒与与含有有四环环素素抗抗性性基因因的的另另一一种种大大肠肠杆杆菌菌质质粒粒pSC101连接接成成重重组组质质粒粒，，具具有有双重抗抗药性性。后来又又把非非洲爪爪蟾核核糖体体基因因片断断同pSC101质粒重重组，，转化化大肠肠杆菌菌，并并在菌菌体内内成功功转录录出相相应的的mRNA。这是是第一一次成成功的的基因因克隆隆实验验。Boyer-Cohen实验StanleyCohenHerbBoyer1986Nobel生理或或医学学奖二.基因工工程的的定义义和特特征定义在体外外将核核酸分分子插插入病病毒、、质粒粒或其其它载载体分分子，，构建建遗传传物质质的新新组合合，并并使之之渗入入到原原先没没有这这类分分子的的寄生生细胞胞内，，而能能持续续稳定定地繁繁殖在体外对不同同生物物的遗传物物质（基因因）进进行剪剪切、、重组、连接接，然然后插插入到到载体分子中中（细细菌质质粒、、病毒毒或噬噬菌体体DNA)，转入微生物物、植植物或或动物物细胞胞内进进行无无性繁繁殖，，并表达出基因因产物物2.特征(1)按照人人们的的主观观愿望望进行行设计计(2)跨越物物种屏屏障外源基基因到到另一一种不不同的的生物物细胞胞内进进行繁繁殖(3)无性扩扩增外源DNA在寄主主细胞胞内可可大量量扩增增，和和高水水平表表达3.基因工工程（（geneengineering）相关关的概概念：：基因操操作（（genemanipulation），重组DNA技术（（recombinantDNAtechnique），基因克克隆（（genecloning），分子克克隆（（molecularcloning）4.Clone(名词)：是指指从一一个共共同祖祖先无无性繁繁殖下下来的的一群群遗传传上同同一的的DNA分子细细胞或或个体体所组组成的的特殊殊的生生命群群体Clone(动词)：是产产生一一个遗遗传上上同一一的DNA分子细细胞或或个体体所组组成的的特殊殊的生生命群群体的的过程程5.研究内内容(1)目的基因的的获取从复杂的生生物基因组组中，经过过酶切消化化或PCR扩增等步骤骤，分离出出带有目的基因的DNA片断(2)重组体的制制备将目的基因因的DNA片断插入到到能自我复制并带有选择性标记记（抗菌素抗抗性）的载体分子上(3)重组体的转转化将重组体（（载体）转入适当的受体体细胞中(4)克隆鉴定挑选转化成功的的细胞克隆隆（含有目目的基因））(5)目的基因表表达使导入寄主主细胞的目目的基因表表达出我们们所需要的的基因产物物第五节基基因工程的的安全性1996年美国国立立卫生研究究院公布了了“重组DNA研究准则”在实验室安安全防护方方面，明确确规定了物物理防护和和生物防护护两个方面面的统一标标准。物理理防护为P1——P4四个等级，，生物防护护则分为EK1———EK3三个不同的的等级1.实验室的物物理安全P1——P4是关于基因因工程实验验室物理安安全防护上上的装备规规定。P1级实验室为为一般的装装备良好的的普通微生生物实验室室；P2级实验室，，在P1级实验室的的基础上，，还需装备备负压的安安全操作柜柜；P3级实验室，，即全负压压的实验室室，同时还还要装备安安全操作柜柜；P4级实验室是是具有最高高安全防护护措施的实实验室，要要求建设专专用的实验验大楼，周周围与其它它建筑物之之间应留有有一定距离离的隔离带带，细菌操操作带手套套进行，以以及使用其其他必要的的隔离装置置，使研究究者不会直直接同细菌菌接触。P=Protect2.实验室的生生物安全生物防护方方面，EK1——EK3级是专门针针对大肠杆杆菌而规定定的安全防防护标准。。它是依据据大肠杆菌菌在自然环环境中的存存活率为前前提制定的的。EK1级大肠杆菌菌菌株，在在自然环境境中一般都都要死亡。。而符合2-3级标准的大大肠杆菌菌菌株，在自自然环境中中则是无法法存活的。。第一个安全全的大肠杆杆菌是K12菌株，由于于不适用于于操作，目目前广泛应应用的是K12的派生菌株。。3.载体的安全应该是失去了了自我迁移的的能力，不不会自动从““安全”的菌菌株转移到““不安全”的的菌株中。二.实验操作的安安全性注意有毒生物物对人的危害害！！！！注意有毒试剂剂对人的危害害！！！！三.基因工程产物物或产品的安安全性转基因作物对对生态环境可可能的影响，，如产生超级级杂草具有除草剂耐耐性因子的转转基因作物的的遗传因子可可能通过授粉粉和种子迁移移传播给野生生植物。获得得这些耐性后后的野生植物物有可能会变变成对一般除除草剂有耐性性的“超级””杂草。为了了清除这些杂杂草，将不得得不使用更强强大的，浓度度更大的除草草剂，这必然然会引起土壤壤板结、土质质变坏、药物物残留等，从从而对生态环环境造成破坏坏。2.标记基因的传传递可能引起起的抗生素耐耐性基因工程技术术中应用的标标记基因通常常是一类抗生生素基因，人人们担心食用用含有此类标标记基因的食食品后，是否否对肠道微生生物产生影响响或者抗生素素类药物产生生耐药性。3.转基因食品引引起的食物过过敏的可能性性转基因食品引引起食物过敏敏的可能性是是人们关注的的焦点之一。。特别是如果果转基因食品品转入的蛋白白质是新蛋白白时，这些异异种蛋白有可可能引起食物物过敏。4.毒性方面，如如蛋白酶抑制制剂，溶血剂剂，神经毒素素许多食品原料料生物本身会会产生大量的的毒性物质，，如蛋白酶抑抑制剂、溶血血剂和神经毒毒素等，那么么转基因作物物中是否有毒毒素以及毒素素的含量就成成为争议的重重要内容之一一5.伦理方面许多民族都有有其独特的饮饮食习惯和制制约，某些宗宗教团体禁止止食用的动物物基因转入他他们通常食用用的动物中（（如将猪的基基因转入绵羊羊中），这可可能触犯某些些民族的饮食食戒律；另外外将动物基因因转入植物中中可能使素食食者感到困惑惑。6.其他除以上争论外外，对转基因因食品安全性性的争议还表表现在微生物物作为宿主细细胞的安全性性问题，转基基因动物激素素、食品、饲饲料添加剂等等对动物本身身的生长、发发育和繁殖的的安全性问题题等方面。基于上述诸多多方面的异议议，转基因食食品的安全性性问题的研究究成为转基因因技术研究的的一个热点。。所以关于GMO（geneticmodifiedoriganism）的争论主要要集中于安全全性，宗教，，贸易四.转基因生物安安全性评价对转基因生物物安全评价主主要集中在环环境安全性和和食用安全性性两个方面。。1.环境安全性评评价环境安全性评评价的核心问问题是转基因因生物是否会会将所转基因因再转移到其其它生物中，，会不会破坏坏生态环境，，打破原有生生物种群的动动态平衡，包括括：：①转转基基因因作作物物本本身身成成为为杂杂草草的的可可能能性性；；②转转基基因因作作物物便便亲亲缘缘野野生生种种成成为为杂杂草草或或超超级级杂杂草草的的可可能能性性；；③转转基基因因作作物物可可能能产产生生新新的的病病毒毒或或疾疾病病；；④转转基基因因作作物物对对非非目目标标生生物物的的危危害害；；⑤转转基基因因作作物物作作为为外外来来种种对对新新环环境境的的入入侵侵，，使使生生物物多多样样性性受受到到威威胁胁；；⑥转基因作物物对生态系统统及生态过程程的影响；⑦其他一些不可可预计的风险险。2.食用安全性评评价食用安全性，，主要包括营营养成分、抗抗营养因、毒毒性和致敏性性等。目前普普遍公认的食食用安全性评评价的原则是是经合组织（（OECD）1993年提出的“实实质等同性””（Substantialequivalence）原则。（1）实质等同性性原则实质等同性原原则最早由国国际经济互助助开发组织于于1993年提出并已被被大多数国家家采用。该原原则认为如果果导入基因后后产生的蛋白白质经确认是是安全的，或或者是转基因因作物和原作作物在主要营营养成分（脂脂肪、蛋白质质、碳水化合合物等）、形形态和是否产产生抗营养因因子、毒性物物质、过敏性性蛋白等方面面没有发生特特殊的变化的的话，则可以以认为转基因因作物在安全全性上和原作作物是同等的的，对人类的的影响是相似似的，则无需需对它的安全全性再作进一一步的分析。。根据“实质等等同性”原则则，转基因食食品安全性分分成三个等级级：I级，转基因食品成成分、营养价价值、体内代代谢途径、杂杂质水平和传传统食品相同同，或变异在在已知的范围围内，这类食食品无需做进进一步的分析析评价；Ⅱ级，与传统食品品极其相似，，但产生或缺缺少某个新成成分或特性，，对不同成分分或特性应作作进一步的分分析评价；Ⅲ级，与传统食品品既不相同也也不相似，需需要作广泛的的营养学和毒毒理学评价。。（2）转基因食品品的食用安全全性转基因食品与与相应的传统统食品相比，，至少存在以以下两个不同同点：一是转转基因食品中中含有利用转转基因技术导导入的外源基基因，而传统统的食品中不不含有；二是是由于外源基基因的表达使使转基因食品品中含有了特特定的外源基基因表达产物物(相应的蛋白质质）。A.外源基因的毒毒性及其水平平转移问题转基因食品中中外源基因含含量很小，其其化学组成与与普通DNA并无差异。通通过食用转基基因食品而摄摄入体内的外外源基因的数数量与消化道道中来源于其其他食品中的的DNA数量相比微不不足道。因此此，转基因食食品中的外源源基因本身不不会对人体产产生直接毒害害作用。转基因食品中中的外源基因因特别是抗生生素抗性基因因（Antibioticresistancegene）被摄入人体体后，水平转转移（Horizontalgenetransfer）至肠道生物物或上皮细胞胞，从而对人人体产生不利利影响的可能能性非常小，，也没有在人人类消化系统统中细菌转化化的报道。转转基因食品中中的卡那霉素素、新霉素和和潮霉素对人人类不存在抗抗生素医疗安安全性的问题题。B.外源基因因编码蛋蛋白的毒毒性与过过敏性问问题评判转基基因食品品中外源源基因编编码蛋白白的食用用安全性性的评定定，一是是根据外外源基因因编码蛋蛋白的化化学组成成判断其其毒性，，二是采采用动物物试验或或模拟试试验的方方法评判判外源基基因编码码蛋白的的毒性。。由于各各国政府府对转基基因食品品的审批批程序中中，对外外源基因因编码蛋蛋白的毒毒性评价价都有严严格的标标准，因因此通过过严格审审查后被被批准商商业化生生产的转转基因食食品中的的外源基基因编码码蛋白对对人体均均无直接接毒性C.外源基因因的次生生效应及及其安全全性问题题外源基因因的次生生效应是是指由于于外源基基因的插插入而对对宿主体体内某些些基因的的表达所所产生的的影响，，现还无无法对外外源基因因的次生生效应进进行控制制和预测测。对外外源基因因的次生生效应可可能对转转基因食食品食用用安全性性产生的的影响，，一般采采用“实实质等同同性”原原则和个个案分析析程序（（case－by－caseprocedure）进行评评价分析析结论：对动、植植物进行行负责任任的遗传传修饰或或使用转转基因技技术在实实质上既既不新也也不会有有危害性性。传统统的遗传传育种与与转基因因技术相相比缺乏乏灵活性性和精确确性，并并因此而而缺乏可可预期性性，其风风险绝不不比转基基因技术术低。夸大转基基因食品品的潜在在危险性性，缺乏乏研究依依据的推推测，可可能会使使消费者者对食品品安全产产生认识识混乱，，从而在在根本上上阻碍转转基因技技术的发发展第六节节基基因工工程的的应用用一理理论论应用用：分分析基基因的的结构构与功功能二基基因工工程实实际应应用1基因工工程与与医药药卫生生目前，，基因因工程程在医医药卫卫生领领域的的应用用非常常广泛泛，主主要包包括以以下两两个方方面：：（1）生产产基因因工程程药品品如如胰胰岛素素、干干扰素素和乙乙肝疫疫苗等等。基基因工工程药药品是是制药药工业业上的的重大大突破破。如1克胰岛岛素（（h-Insulin）要从从7.5公斤新新鲜猪猪或牛牛胰脏脏组织织中提提取得得到，，而目目前世世界上上糖尿尿病患患者有有6000万人人，，每每人人每每年年约约需需1克胰胰岛岛素素，，这这样样总总计计需需从从45亿公公斤斤新新鲜鲜胰胰脏脏中中提提取取,利用用基基因因工工程程的的"工程程菌菌"生产产1克胰胰岛岛素素，，只只需需20升发发酵酵液液。。生长长激激素素释释放放因因子子““SRIH””的动动物物激激素素（（一一种种十十四四肽肽，，能能抑抑制制其其他他激激素素的的释释放放和和治治疗疗糖糖尿尿病病等等）），，它它原原来来要要从从羊羊的的脑脑下下垂垂体体中中提提取取，，50万头头羊羊也也只只能能提提取取5mg的产产品品，，而而现现在在只只要要用用10L发酵酵液液就就可可获获得得同同样样的的产产量量。。商品名称英文名缩写开发公司胰岛素HumulinNovolinHumalogInsulinlispoinsulinLillyNovoNordiskLilly人生长激素ProtropinHumatropeNutropinAQrhuGHGenentechLillyGenentech干扰素IntronAReferonAAvonixBetaseronActimmuneAlferon-NrhuIFNa2brhuIFNa2arhuIFNrhuIFN1brhuIFN1brhuIFNa3ScheringRocheBiogenChironGenentechInterferonScienceKogenateRecombinateFactorVIIIBayerBaxter葡萄脑苷脂酶CerezymeglucocerebrosidaseGenzyml脱氧核糖核酸酶PulmozymedomaseGenentech乙型肝炎疫苗RecombivaxHBEngerixBComraxHepatitisBvaccineMerckSmithKlineMerck甲型肝炎疫苗HavrixHepatitisBvaccineSmithKline（2）用用于于基基因因诊诊断断与与基基因因治治疗疗基因因工工程程技技术术还还可可以以直直接接用用于于基基因因的的诊诊断断和和治治疗疗。。目目前前用用基基因因诊诊断断方方法法已已经经能能够够检检测测出出肠肠道道病病毒毒、、单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒等等许许多多种种病病毒毒。。基因治疗是把把健康的外源源基因导入有有基因缺陷的的细胞中，达达到治疗疾病病的目的，如如恶性肿瘤、、艾滋病、心心血管疾病，，以及糖尿病病等，也都可可以被人类征征服3基因工程与农农业、食品工工业（1）培育高产、、优质或具有有特殊用途的的动植物、微微生物新品种种（2）培育各种抗抗逆性的作物物新品种（3）为人类开辟辟新的食物来来源21个种植生物技技术作物的国国家包括11个发展中国家家和10个工业化国家家。按种植面面积的大小顺顺序排列，它它们分别是美美国、阿根廷廷、巴西、加加拿大、中国国、巴拉圭、、印度、南非非、乌拉圭、、澳大利亚、、墨西哥、罗罗马尼亚、菲菲律宾、西班班牙、哥伦比比亚、伊朗、、洪都拉斯、、葡萄牙、德德国、法国和和捷克共和国国。2005年，美国、阿阿根廷、巴西西、加拿大和和中国仍是全全球主要的生生物技术作物物种植国。美美国种植的4980万公顷生物技技术作物（占占此类作物全全球种植面积积的55％）中，大约约