荧光和化学发光分析法课件

13:26:1819:25:47113:26:18Stokes用分光计观察到：荧光的波长比入射光的波长稍微长些五颜六色雨后路面上水珠油膜呈现19:25:47Stokes用分光计观察到：五颜六色雨后路213:26:18

基态分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)，电子由基态跃迁到激发态，当电子由激发态返回基态时，以发射电磁辐射(即光)的形式释放能量。

分子发光：分子+电能化学能光能生物活性参与化学发光

电致发光化学发光光致发光生物发光荧光磷光19:25:47基态分子吸收能量(电能、热能、化学能或光313:26:18分子发光：光致发光：光19:25:48分子发光：光致发光：光413:26:182.1荧光分析法2.1.1荧光分析法基本概念2.1.2荧光强度及影响因素2.1.3仪器装置2.1.4定量分析方法2.1.5荧光分析测定方法、特点和应用19:25:482.1荧光分析法2.1.1荧光分析法基本513:26:18A分子的激发态————分子激发态和三线激发态激发态：基态分子吸收能量后，价层电子跃迁到高能级的分子轨道上称为电子激发态

。是分子的亚稳定状态。基态：

在正常状态下，分子处于最低能级的分子轨道上称为基态。是分子的稳定状态。2.1.1荧光分析法基本概念2.1.1.1荧光及其产生19:25:48A分子的激发态————分子激发态和三线激发613:26:18

电子自旋多重度

电子从基态跃迁到激发态，分子中的电子可以处在不同的自旋状态,常用电子自旋多重度来描述。M=2S+1S是电子的总自旋量子数，各电子自旋量子数的代数和。2.1.1.1荧光及其产生19:25:48电子自旋多重度电子从基态跃迁到激713:26:18

单重态（M=1）：电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用“S”表示。

三重态（M=3）：分子中的电子对的电子自旋平行的电子态称为三重态，用“T”表示。S2>T2>S1>T1>S0

(洪特规则)

M=2S+1M自旋多重度S总自旋量子数2.1.1.1荧光及其产生19:25:48单重态（M=1）：电子自旋都813:26:182023/1/4S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫分子荧光和磷光发射过程19:25:482022/12/29S2S1S0T1吸发发系913:26:18

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和非辐射跃迁(热)等方式失去能量。传递途径辐射跃迁荧光磷光内转换系间跨越振动弛豫非辐射跃迁延迟荧光外转换返回速度快的途径，发生几率大!B分子去激发过程及荧光的产生2.1.1.1荧光及其产生19:25:55电子处于激发态是不稳定状态，返回基1013:26:18e（1）.

振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动时间10-11~10-13s。1、非辐射跃迁2.1.1.1荧光及其产生19:25:56e（1）.振动弛豫：同一电子能级内以热能量1113:26:18e（2）.

内转换：相同多重度的电子能级中,

相等能级间的非辐射能级交换。发生内转换的时间10-12s。2.1.1.1荧光及其产生19:25:56e（2）.内转换：相同多重度的电子能级中,1213:26:18e（3）.系间跨越：不同多重态在有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。电子自旋改变，跃迁禁阻，通过自旋-轨道耦合等跃迁。2.1.1.1荧光及其产生19:25:56e（3）.系间跨越：不同多重态在有重叠的转1313:26:18（4）.外转换：激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而损失能量回到基态的非辐射跃迁。

外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。2.1.1.1荧光及其产生19:25:57（4）.外转换：激发态分子与溶剂或其他分子1413:26:18（1）.

荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态各振动能级，发射时间约为10-7～10-9s。

发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。

e2、辐射跃迁2.1.1.1荧光及其产生19:25:57（1）.荧光发射：电子由第一激发单重态的最1513:26:18（2）.

磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态各振动能级。发光时间：10-4～10s。eS0

→激发态→振动弛豫→内转换→系间跨越→振动弛豫→

T1

→S0

2.1.1.1荧光及其产生19:25:57（2）.磷光发射：电子由第一激发三重态的最1613:26:181、荧光激发光谱

固定荧光测量波长，改变激发光的波长，测量不同波长λex激发光照射下荧光强度的变化，记录荧光强度F与激发光波长的关系曲线。2.1.1.2荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线19:25:581、荧光激发光谱固定荧光测量波长，改1713:26:182、荧光发射光谱

固定激发光波长和强度，记录在不同波长λem下所发射的荧光强度所得关系曲线即不同波长下荧光强度的分布。发射光谱的形状与激发波长无关。2.1.1.2荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线19:25:582、荧光发射光谱固定激发光波长和1813:26:18

荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系

2.1.1.2荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线

吸收光谱的形状表明了分子第一激发单重态的振动能级；发射光谱表明分子基态的振动能级结构。

基态与激发态两者的振动能级结构相似，激发与去激发组成相反的两个过程。S03210S1321019:25:58荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系2.1.1913:26:18

分子产生荧光必须具备的条件1.

具有合适的结构：通常是含有苯环和稠环的刚性结构的有机分子；2.

具有一定的荧光量子产率。2.1.1.3荧光效率19:25:59分子产生荧光必须具备的条件1.具有合适的2013:26:18Φ=发射荧光的分子数激发分子总数2.1.1.3荧光效率荧光量子产率（Φ）：

衡量荧光物质发光能力。它表示激发分子发射出荧光(或磷光)

的比例。19:25:59Φ=发射荧光的分子数激发分子总数2.1.1.2113:26:18

荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，可用各过程的速率常数来表示荧光量子产率：荧光发射过程的速率常数，取决于分子结构。各种非辐射跃迁过程的速率常数之和。取决于分子所处的化学环境，同时也与化学结构有关。2.1.1.3荧光效率19:26:00荧光量子产率与激发态能量释放2213:26:18

荧光分子与其他分子相互作用引起荧光强度降低甚至荧光消失的现象为荧光猝灭，又称荧光熄灭。（1）、碰撞猝灭---动态猝灭

M*+Q→M+Q+热量激发态分子猝灭剂2.1.1.4猝灭19:26:00荧光分子与其他分子相互作用2313:26:18（2）、生成化合物的猝灭---静态猝灭

M+Q→MQ

基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。2.1.1.4猝灭（3）、能量转移

M*+Q→M+

Q*

激发态的分子与猝灭剂作用，能量发生转移，猝灭剂被激发。19:26:00（2）、生成化合物的猝灭---静态猝灭2413:26:18（5）、自猝灭

荧光物质的浓度较大时，激发态分子之间碰撞较多，在碰撞中引起能量损失，产生自熄，使荧光强度减小。2.1.1.4猝灭（4）、氧的猝灭

氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，可能包含着多种机理。

19:26:01（5）、自猝灭荧光物质的浓度2513:26:182.1.2荧光强度及影响因素2.1.2.1荧光强度与溶液浓度的关系2.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系2.1.2.3金属离子螯合物的荧光2.1.2.4实验条件对荧光强度的影响19:26:012.1.2荧光强度及影响因素2.1.2.12613:26:18Epsilon（大写Ε，小写ε），是第五个希腊字母。汉字读音：艾普西龙朗伯-比尔定律P1519:26:01Epsilon（大写Ε，小写ε），是第五个希2713:26:18A跃迁的类型

n→π*εmax＜100平均寿命10-5~10-7s；π→π*εmax≥104

平均寿命10-7~10-8sπ*→π是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型，具有π*→π共轭双键的分子才能发射较强的荧光。2.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系荧光的产生是分子先经历π→π*或n→π*激发，然后经振动弛豫或其他非辐射跃迁再发生π*→π或π*→n而得到荧光。19:26:01A跃迁的类型π*→π是有机化合物产2813:26:18B共轭效应

产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，荧光量子产率越高，向长波方向移动。化合物量子产率φF

λex（nm）λem（nm）苯萘蒽丁省2052863653902.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系0.110.280.360.5227832140448019:26:02B共轭效应产生荧光的有机物质，都含有共轭2913:26:18C分子共平面效应芴Φ

=1联苯Φ

=0.2荧光分子的共平面性增加，则共轭体系大，有利于π→π*

跃迁。2.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系19:26:03C分子共平面效应芴Φ=1联苯Φ=3013:26:18荧光黄Φ

=0.92酚酞Φ

=02.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系19:26:03荧光黄Φ=0.92酚酞Φ=023113:26:18D取代基效应1.

给电子取代基加强荧光-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR，-CN产生p→π共轭2.

吸电子取代基减弱荧光-C=O，-COOH，-NO2摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨跃较大，同样使荧光减弱。

2.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系19:26:03D取代基效应1.给电子取代基加强荧光-N3213:26:18D取代基效应2.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系A跃迁的类型B共轭效应C分子共平面效应19:26:04D取代基效应2.1.2.2有机物的荧光与3313:26:182.1.2.3金属离子螯合物的荧光（2）螯合物中金属离子的发光（1）螯合物中配位体的发光19:26:042.1.2.3金属离子螯合物的荧光（2）螯3413:26:182.1.2.3金属离子螯合物的荧光（1）螯合物中配位体的发光

不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。19:26:042.1.2.3金属离子螯合物的荧光（1）螯3513:26:182.1.2.3金属离子螯合物的荧光

这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd

跃迁和ff跃迁，最终发射的是dd跃迁和ff跃迁光谱。（2）螯合物中金属离子的发光19:26:052.1.2.3金属离子螯合物的荧光3613:26:182、溶剂3、溶液黏度和温度

4、溶液的PH值2.1.2.4实验条件对荧光强度的影响1、激发光源19:26:052、溶剂3、溶液黏度和温度4、溶液的PH值3713:26:182.1.2.4实验条件对荧光强度的影响1、激发光源激发光强度I0大，荧光强度增大，灵敏度增高。2、溶剂

主要表现为溶剂的极性、氢键、配位键的形成对化合物的荧光发生变化。

*→跃迁类型：溶剂极性增大，跃迁能量降低，发生红移，荧光增强。氢键、配位键的形成主要影响荧光分子的存在型体、电离状态，荧光强度和形状均发生很大变化。19:26:052.1.2.4实验条件对荧光强度的影响1、3813:26:183、溶液黏度和温度

黏度大，温度低，可减小碰撞引起的荧光熄灭，荧光强度增大。温度升高，外转换的几率增加，荧光强度降低。4、溶液的PH值不同PH值下，荧光分子存在形式不同。2.1.2.4实验条件对荧光强度的影响19:26:053、溶液黏度和温度黏度大，温度低，可减小碰3913:26:182.1.3仪器装置CaryEclipse荧光分光光度计荧光、磷光化学/生物发光美国瓦里安技术中国有限公司19:26:062.1.3仪器装置CaryEclipse4013:26:18一、荧光分光光度计结构流程

2.1.3仪器装置光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器组成：激发光源、样品池、双单色器、检测器、显示系统。特殊点：两个单色器，光源与检测器通常成直角。19:26:06一、荧光分光光度计结构流程2.1.3仪器4113:26:181、激发光源

汞灯、碘钨灯、氙弧灯、激光等。2、样品池

I0ItIf样品池四面透光。2.1.3仪器装置19:26:061、激发光源汞灯、碘钨灯、氙弧灯、激光等。4213:26:184、检测器

一般采用硒光电池。检测器的方向与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。

3、单色器

激发单色器：选择激发光波长，用以分离出所需用的激发光。发射单色器：选择荧光发射波长，用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射的荧光。

2.1.3仪器装置19:26:074、检测器一般采用硒光电池。3、单色器激4313:26:18二、磷光分光光度计结构流程

光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器斩波器（磷光镜）利用荧光和磷光发射寿命的差别通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。19:26:07二、磷光分光光度计结构流程光源样品池激发检4413:26:182、定量方法

1、定量依据

2.1.4定量分析方法19:26:082、定量方法1、定量依据2.1.4定量4513:26:181、定量依据

荧光强度

If

正比于吸收的光强度

Ia和荧光量子产率Φ：由朗伯-比耳定律得：荧光强度If

：2.1.4定量分析方法19:26:081、定量依据荧光强度If正4613:26:18对于稀溶液，当2.303bC<0.05时：

If

----荧光强度I0

----入射光强度Φf----荧光量子产率b--吸收光程--摩尔吸光系数C--物质浓度2.1.4定量分析方法19:26:09对于稀溶液，当2.303bC<0.04713:26:182、定量方法

标准曲线法：FCsFxCx2.1.4定量分析方法19:26:092、定量方法标准曲线法：FCsFxCx2.4813:26:18A无机化合物的荧光分析如Mg、Al、Ca等，本身不发射荧光，但与有机试剂可形成荧光配合物进行定量测定；

直接法：如8-羟基喹啉与Al离子反应生成荧光配合物

安息香，水杨醛缩邻氨基苯酚，黄酮醇，二苯乙醇酮

2.1.5荧光分析测定方法、特点和应用19:26:09A无机化合物的荧光分析2.1.5荧光分析4913:26:18荧光熄灭法19:26:10荧光熄灭法5013:26:18B有机化合物的荧光分析本身发射荧光的，如罗丹明B、荧光素等可直接测定；不发射荧光的物质可经过处理后成为发射荧光的物质进行测定；19:26:10B有机化合物的荧光分析5113:26:18C：蛋白质的荧光分析蛋白质的基本结构，有的氨基酸自身可以发荧光，例如：酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸19:26:10C：蛋白质的荧光分析5213:26:182.荧光胺和氨基反应生成具有荧光的产物3.邻苯二甲醛（OPA）在一定的条件下可与伯胺、多胺生成具有荧光的产物19:26:102.荧光胺和氨基反应生成3.邻苯二甲醛（OP5313:26:18D核酸检测生命物质常选用一些荧光分子作为探针，通过探针标记分子的荧光变化来研究脱氧核糖酸(DNA)与小分子及药物的作用机理，从而探讨致病原因及筛选和设计新的高效低毒药物。19:26:10D核酸检测生命物质54化合物对DNA的安全性电泳后点样处abcdpUC19(2686bp)质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，buffer:50mMTris-HCl/50mMNaCl

(Ph7.4)，化合物2.0uM浓度下的损伤测试（37℃1h）a:DNA空白对照b:巯基乙胺(12.0uM)+DNAc:DNA+2.0uM化合物d:巯基乙胺+DNA+2.0uM化合物化合物对DNA的安全性电泳后点样处abcdpUC19(265513:26:18分子磷光分析法特点

发光速率慢寿命比荧光长10-4—10s

辐射的波长比荧光的长

磷光的发光寿命和辐射强度对重原子及其敏感（使用含碘甲烷的混合溶剂）

受温度影响大，低温强度大

19:26:11分子磷光分析法特点5613:26:18稠环芳烃和杂环化合物具有较大的致癌性19:26:11稠环芳烃和杂环化合物具有较大的致癌性5713:26:18DDT等52种农药植物生长激素（0.001mg/mL）血液和尿中的阿司匹林、苯巴比妥可卡因、致幻剂、抗凝剂19:26:11DDT等52种农药血液和尿中的阿司匹林、苯巴5813:26:18作业1.激发态分子去激发的过程有哪些?荧光发射和磷光发射经过哪些过程?为什么磷光发射比荧光发射慢?2.为什么有的分子能够发射荧光,有的不能?有机物的荧光与其结构的关系是怎样的?3.根据所学知识，写出2个可能发出荧光的化合物，并阐明为什么有可能发出荧光19:26:11作业1.激发态分子去激发的过程有哪些?荧5913:26:1819:25:476013:26:18Stokes用分光计观察到：荧光的波长比入射光的波长稍微长些五颜六色雨后路面上水珠油膜呈现19:25:47Stokes用分光计观察到：五颜六色雨后路6113:26:18

基态分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)，电子由基态跃迁到激发态，当电子由激发态返回基态时，以发射电磁辐射(即光)的形式释放能量。

分子发光：分子+电能化学能光能生物活性参与化学发光

电致发光化学发光光致发光生物发光荧光磷光19:25:47基态分子吸收能量(电能、热能、化学能或光6213:26:18分子发光：光致发光：光19:25:48分子发光：光致发光：光6313:26:182.1荧光分析法2.1.1荧光分析法基本概念2.1.2荧光强度及影响因素2.1.3仪器装置2.1.4定量分析方法2.1.5荧光分析测定方法、特点和应用19:25:482.1荧光分析法2.1.1荧光分析法基本6413:26:18A分子的激发态————分子激发态和三线激发态激发态：基态分子吸收能量后，价层电子跃迁到高能级的分子轨道上称为电子激发态

。是分子的亚稳定状态。基态：

在正常状态下，分子处于最低能级的分子轨道上称为基态。是分子的稳定状态。2.1.1荧光分析法基本概念2.1.1.1荧光及其产生19:25:48A分子的激发态————分子激发态和三线激发6513:26:18

电子自旋多重度

电子从基态跃迁到激发态，分子中的电子可以处在不同的自旋状态,常用电子自旋多重度来描述。M=2S+1S是电子的总自旋量子数，各电子自旋量子数的代数和。2.1.1.1荧光及其产生19:25:48电子自旋多重度电子从基态跃迁到激6613:26:18

单重态（M=1）：电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用“S”表示。

三重态（M=3）：分子中的电子对的电子自旋平行的电子态称为三重态，用“T”表示。S2>T2>S1>T1>S0

(洪特规则)

M=2S+1M自旋多重度S总自旋量子数2.1.1.1荧光及其产生19:25:48单重态（M=1）：电子自旋都6713:26:182023/1/4S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫分子荧光和磷光发射过程19:25:482022/12/29S2S1S0T1吸发发系6813:26:18

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和非辐射跃迁(热)等方式失去能量。传递途径辐射跃迁荧光磷光内转换系间跨越振动弛豫非辐射跃迁延迟荧光外转换返回速度快的途径，发生几率大!B分子去激发过程及荧光的产生2.1.1.1荧光及其产生19:25:55电子处于激发态是不稳定状态，返回基6913:26:18e（1）.

振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动时间10-11~10-13s。1、非辐射跃迁2.1.1.1荧光及其产生19:25:56e（1）.振动弛豫：同一电子能级内以热能量7013:26:18e（2）.

内转换：相同多重度的电子能级中,

相等能级间的非辐射能级交换。发生内转换的时间10-12s。2.1.1.1荧光及其产生19:25:56e（2）.内转换：相同多重度的电子能级中,7113:26:18e（3）.系间跨越：不同多重态在有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。电子自旋改变，跃迁禁阻，通过自旋-轨道耦合等跃迁。2.1.1.1荧光及其产生19:25:56e（3）.系间跨越：不同多重态在有重叠的转7213:26:18（4）.外转换：激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而损失能量回到基态的非辐射跃迁。

外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。2.1.1.1荧光及其产生19:25:57（4）.外转换：激发态分子与溶剂或其他分子7313:26:18（1）.

荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态各振动能级，发射时间约为10-7～10-9s。

发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。

e2、辐射跃迁2.1.1.1荧光及其产生19:25:57（1）.荧光发射：电子由第一激发单重态的最7413:26:18（2）.

磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态各振动能级。发光时间：10-4～10s。eS0

→激发态→振动弛豫→内转换→系间跨越→振动弛豫→

T1

→S0

2.1.1.1荧光及其产生19:25:57（2）.磷光发射：电子由第一激发三重态的最7513:26:181、荧光激发光谱

固定荧光测量波长，改变激发光的波长，测量不同波长λex激发光照射下荧光强度的变化，记录荧光强度F与激发光波长的关系曲线。2.1.1.2荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线19:25:581、荧光激发光谱固定荧光测量波长，改7613:26:182、荧光发射光谱

固定激发光波长和强度，记录在不同波长λem下所发射的荧光强度所得关系曲线即不同波长下荧光强度的分布。发射光谱的形状与激发波长无关。2.1.1.2荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线19:25:582、荧光发射光谱固定激发光波长和7713:26:18

荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系

2.1.1.2荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线

吸收光谱的形状表明了分子第一激发单重态的振动能级；发射光谱表明分子基态的振动能级结构。

基态与激发态两者的振动能级结构相似，激发与去激发组成相反的两个过程。S03210S1321019:25:58荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系2.1.7813:26:18

分子产生荧光必须具备的条件1.

具有合适的结构：通常是含有苯环和稠环的刚性结构的有机分子；2.

具有一定的荧光量子产率。2.1.1.3荧光效率19:25:59分子产生荧光必须具备的条件1.具有合适的7913:26:18Φ=发射荧光的分子数激发分子总数2.1.1.3荧光效率荧光量子产率（Φ）：

衡量荧光物质发光能力。它表示激发分子发射出荧光(或磷光)

的比例。19:25:59Φ=发射荧光的分子数激发分子总数2.1.1.8013:26:18

荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，可用各过程的速率常数来表示荧光量子产率：荧光发射过程的速率常数，取决于分子结构。各种非辐射跃迁过程的速率常数之和。取决于分子所处的化学环境，同时也与化学结构有关。2.1.1.3荧光效率19:26:00荧光量子产率与激发态能量释放8113:26:18

荧光分子与其他分子相互作用引起荧光强度降低甚至荧光消失的现象为荧光猝灭，又称荧光熄灭。（1）、碰撞猝灭---动态猝灭

M*+Q→M+Q+热量激发态分子猝灭剂2.1.1.4猝灭19:26:00荧光分子与其他分子相互作用8213:26:18（2）、生成化合物的猝灭---静态猝灭

M+Q→MQ

基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。2.1.1.4猝灭（3）、能量转移

M*+Q→M+

Q*

激发态的分子与猝灭剂作用，能量发生转移，猝灭剂被激发。19:26:00（2）、生成化合物的猝灭---静态猝灭8313:26:18（5）、自猝灭

荧光物质的浓度较大时，激发态分子之间碰撞较多，在碰撞中引起能量损失，产生自熄，使荧光强度减小。2.1.1.4猝灭（4）、氧的猝灭

氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，可能包含着多种机理。

19:26:01（5）、自猝灭荧光物质的浓度8413:26:182.1.2荧光强度及影响因素2.1.2.1荧光强度与溶液浓度的关系2.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系2.1.2.3金属离子螯合物的荧光2.1.2.4实验条件对荧光强度的影响19:26:012.1.2荧光强度及影响因素2.1.2.18513:26:18Epsilon（大写Ε，小写ε），是第五个希腊字母。汉字读音：艾普西龙朗伯-比尔定律P1519:26:01Epsilon（大写Ε，小写ε），是第五个希8613:26:18A跃迁的类型

n→π*εmax＜100平均寿命10-5~10-7s；π→π*εmax≥104

平均寿命10-7~10-8sπ*→π是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型，具有π*→π共轭双键的分子才能发射较强的荧光。2.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系荧光的产生是分子先经历π→π*或n→π*激发，然后经振动弛豫或其他非辐射跃迁再发生π*→π或π*→n而得到荧光。19:26:01A跃迁的类型π*→π是有机化合物产8713:26:18B共轭效应

产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，荧光量子产率越高，向长波方向移动。化合物量子产率φF

λex（nm）λem（nm）苯萘蒽丁省2052863653902.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系0.110.280.360.5227832140448019:26:02B共轭效应产生荧光的有机物质，都含有共轭8813:26:18C分子共平面效应芴Φ

=1联苯Φ

=0.2荧光分子的共平面性增加，则共轭体系大，有利于π→π*

跃迁。2.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系19:26:03C分子共平面效应芴Φ=1联苯Φ=8913:26:18荧光黄Φ

=0.92酚酞Φ

=02.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系19:26:03荧光黄Φ=0.92酚酞Φ=029013:26:18D取代基效应1.

给电子取代基加强荧光-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR，-CN产生p→π共轭2.

吸电子取代基减弱荧光-C=O，-COOH，-NO2摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨跃较大，同样使荧光减弱。

2.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系19:26:03D取代基效应1.给电子取代基加强荧光-N9113:26:18D取代基效应2.1.2.2有机物的荧光与其结构的关系A跃迁的类型B共轭效应C分子共平面效应19:26:04D取代基效应2.1.2.2有机物的荧光与9213:26:182.1.2.3金属离子螯合物的荧光（2）螯合物中金属离子的发光（1）螯合物中配位体的发光19:26:042.1.2.3金属离子螯合物的荧光（2）螯9313:26:182.1.2.3金属离子螯合物的荧光（1）螯合物中配位体的发光

不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。19:26:042.1.2.3金属离子螯合物的荧光（1）螯9413:26:182.1.2.3金属离子螯合物的荧光

这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd

跃迁和ff跃迁，最终发射的是dd跃迁和ff跃迁光谱。（2）螯合物中金属离子的发光19:26:052.1.2.3金属离子螯合物的荧光9513:26:182、溶剂3、溶液黏度和温度

4、溶液的PH值2.1.2.4实验条件对荧光强度的影响1、激发光源19:26:052、溶剂3、溶液黏度和温度4、溶液的PH值9613:26:182.1.2.4实验条件对荧光强度的影响1、激发光源激发光强度I0大，荧光强度增大，灵敏度增高。2、溶剂

主要表现为溶剂的极性、氢键、配位键的形成对化合物的荧光发生变化。

*→跃迁类型：溶剂极性增大，跃迁能量降低，发生红移，荧光增强。氢键、配位键的形成主要影响荧光分子的存在型体、电离状态，荧光强度和形状均发生很大变化。19:26:052.1.2.4实验条件对荧光强度的影响1、9713:26:183、溶液黏度和温度

黏度大，温度低，可减小碰撞引起的荧光熄灭，荧光强度增大。温度升高，外转换的几率增加，荧光强度降低。4、溶液的PH值不同PH值下，荧光分子存在形式不同。2.1.2.4实验条件对荧光强度的影响19:26:053、溶液黏度和温度黏度大，温度低，可减小碰9813:26:182.1.3仪器装置CaryEclipse荧光分光光度计荧光、磷光化学/生物发光美国瓦里安技术中国有限公司19:26:062.1.3仪器装置CaryEclipse9913:26:18一、荧光分光光度计结构流程

2.1.3仪器装置光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器组成：激发光源、样品池、双单色器、检测器、显示系统。特殊点：两个单色器，光源与检测器通常成直角。19:26:06一、荧光分光光度计结构流程2.1.3仪器10013:26:181、激发光源

汞灯、碘钨灯、氙弧灯、激光等。2、样品池

I0ItIf样品池四面透光。2.1.3仪器装置19:26:061、激发光源汞灯、碘钨灯、氙弧灯、激光等。10113:26:184、检测器

一般采用硒光电池。检测器的方向与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。

3、单色器

激发单色器：选择激发光波长，用以分离出所需用的激发光。发射单色器：选择荧光发射波长，用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射的荧光。

2.1.3仪器装置19:26:074、检测器一般采用硒光电池。3、单色器激10213:26:18二、磷光分光光度计结构流程

光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器斩波器（磷光镜）利用荧光和磷光发射寿命的差别通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。19:26:07二、磷光分光光度计结构流程光源样品池激发检10313:26:182、定量方法

1、定量依据

2.1.4定量分析方法19:26:082、定量方法1、定量依据2.1.4定量10413:26:181、定量依据

荧光强度

If

正比于吸收的光强度

Ia和荧光