PCR-教学讲解课件

聚合酶链反应（PCR）聚合酶链（PCR）技术PCR反应体系PCR技术过程及原理.聚合酶链反应（PCR）聚合酶链（PCR）技术PCR反应体系P1聚合酶链反应技术聚合酶链反应（PCR）技术是一个能在试管内模仿细胞内核酸复制过程，也就是能在体外特异地扩增一段特定核酸序列的技术.聚合酶链反应技术聚合酶链反应（PCR）技术是一个能在试管内模2PCR的反应体系参与PCR反应的成分：模板引物

dNTPTaqDNA聚合酶Mg2+缓冲液.PCR的反应体系参与PCR反应的成分：模板引物dN3模板：即为要被复制的核酸片段条件：需要较高的纯度.模板：即为要被复制的核酸片段.4引物：化学合成的寡核苷酸条件：1.一般长度为20个核苷酸2.两条引物的序列不能互补3.两条引物之间的Tm值不能相差太多.引物：化学合成的寡核苷酸.5dNTP:4种核苷酸条件：4种核苷酸的浓度需要一致，否则容易出现DNA聚合酶错配的概率.dNTP:4种核苷酸.6TaqDNA聚合酶：是从水栖嗜热菌中提取的一种酶，能催化DNA合成。具有5’端→3’端的外切酶活性。.TaqDNA聚合酶：是从水栖嗜热菌中提取的一种酶，能催化D7Mg2+：是TaqDNA聚合酶的辅助因子，可以稳定其活性.Mg2+：是TaqDNA聚合酶的辅助因子，可以稳定其活性.8缓冲液：在扩增过程中使PH值维持在7.2左右，使DNA聚合酶发挥最大的活性.缓冲液：在扩增过程中使PH值维持在7.2左右，使DNA聚合酶9PCR技术基本过程变性退火延伸.PCR技术基本过程变性.10变性在熔点温度的条件下（94℃左右），使双链DNA结构的氢键断裂，形成两条单链分子作为扩增反应的模板，以便与引物结合。94℃DNA双链解开.变性在熔点温度的条件下（94℃左右），使双链DNA结构的氢键11退火将反应体系温度将至熔点温度以下（40~70℃），以便使引物与模板DNA序列互补，形成杂交链。

40~70℃

引物与DNA模板杂交

.退火将反应体系温度将至熔点温度以下（40~70℃），以便使引12延伸将反应体系的温度升至72℃，此时反应体系按照模板链的序列以碱基互补配对的原则一次把dNTP加至引物的3’端，在TaqDNA聚合酶的作用下，杂交链不断延伸，直至形成新的DNA双链。新的DNA又可以作为下一个模板进行扩增，如此反复循环，可以到达数十万倍到百万倍的扩增数

72℃4种dNTP在引物和DNA聚合酶的

的作用下延伸

.延伸将反应体系的温度升至72℃，此时反应体系按照模板链的序列13定量PCR技术指在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。.定量PCR技术指在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信14Taqman荧光探针：5’端荧光基团FAM

3’端淬灭基团

.Taqman荧光探针：.15

PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使探针上的荧光基团和淬灭基团分离，使荧光基团在激发光作用下发出荧光；每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。16.PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针

荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)。阈值线实时定量PCR的两个重要概念17.荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标Ct值(cyclethreshold)的概念指PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号)到达阈值时所经过的扩增循环次数。它与起始拷贝数的对数成线性关系（即与起始拷贝数反比关系）C(t)值C(t)值18.12+/0.04-阈值线18.Ct值(cyclethreshold)的概念方法学评价：优点：杂交效率高缺点：荧光淬灭难以彻底，本底较高探针的水解依赖于Taq酶的外切活性，故受酶性能和试剂质量影响.方法学评价：.19聚合酶链反应（PCR）聚合酶链（PCR）技术PCR反应体系PCR技术过程及原理.聚合酶链反应（PCR）聚合酶链（PCR）技术PCR反应体系P20聚合酶链反应技术聚合酶链反应（PCR）技术是一个能在试管内模仿细胞内核酸复制过程，也就是能在体外特异地扩增一段特定核酸序列的技术.聚合酶链反应技术聚合酶链反应（PCR）技术是一个能在试管内模21PCR的反应体系参与PCR反应的成分：模板引物

dNTPTaqDNA聚合酶Mg2+缓冲液.PCR的反应体系参与PCR反应的成分：模板引物dN22模板：即为要被复制的核酸片段条件：需要较高的纯度.模板：即为要被复制的核酸片段.23引物：化学合成的寡核苷酸条件：1.一般长度为20个核苷酸2.两条引物的序列不能互补3.两条引物之间的Tm值不能相差太多.引物：化学合成的寡核苷酸.24dNTP:4种核苷酸条件：4种核苷酸的浓度需要一致，否则容易出现DNA聚合酶错配的概率.dNTP:4种核苷酸.25TaqDNA聚合酶：是从水栖嗜热菌中提取的一种酶，能催化DNA合成。具有5’端→3’端的外切酶活性。.TaqDNA聚合酶：是从水栖嗜热菌中提取的一种酶，能催化D26Mg2+：是TaqDNA聚合酶的辅助因子，可以稳定其活性.Mg2+：是TaqDNA聚合酶的辅助因子，可以稳定其活性.27缓冲液：在扩增过程中使PH值维持在7.2左右，使DNA聚合酶发挥最大的活性.缓冲液：在扩增过程中使PH值维持在7.2左右，使DNA聚合酶28PCR技术基本过程变性退火延伸.PCR技术基本过程变性.29变性在熔点温度的条件下（94℃左右），使双链DNA结构的氢键断裂，形成两条单链分子作为扩增反应的模板，以便与引物结合。94℃DNA双链解开.变性在熔点温度的条件下（94℃左右），使双链DNA结构的氢键30退火将反应体系温度将至熔点温度以下（40~70℃），以便使引物与模板DNA序列互补，形成杂交链。

40~70℃

引物与DNA模板杂交

.退火将反应体系温度将至熔点温度以下（40~70℃），以便使引31延伸将反应体系的温度升至72℃，此时反应体系按照模板链的序列以碱基互补配对的原则一次把dNTP加至引物的3’端，在TaqDNA聚合酶的作用下，杂交链不断延伸，直至形成新的DNA双链。新的DNA又可以作为下一个模板进行扩增，如此反复循环，可以到达数十万倍到百万倍的扩增数

72℃4种dNTP在引物和DNA聚合酶的

的作用下延伸

.延伸将反应体系的温度升至72℃，此时反应体系按照模板链的序列32定量PCR技术指在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。.定量PCR技术指在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信33Taqman荧光探针：5’端荧光基团FAM

3’端淬灭基团

.Taqman荧光探针：.34

PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使探针上的荧光基团和淬灭基团分离，使荧光基团在激发光作用下发出荧光；每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。35.PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针

荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)。阈值线实时定量PCR的两个重要概念36.荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标Ct值(cyclethresh