基因测序-课件

基因测序技术

蔡悦

0基因测序技术0DNA双螺旋1953中心法则1958PCR1983DNA重组技术1974遗传密码1966DNA是遗传物质19521950200019901980197019602010第一台自动测序仪1986毛细管电泳测序仪1996荧光ddNTP第一台商用自动测序仪1987化学降解法和sanger1977Illumina200637001998Solidsystem20074542005Heliscope2008Nanopore2008Smrt20091DNA双螺旋1953PCRDNA重组技术1974遗传密码19第一代基因测序技术

1977年桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础1.1975年由（Sanger）和（Coulson）开创的双脱氧链终止法

2.1977年吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）3.在sanger法基础上发展而来的各种DNA测序技术2第一代基因测序技术1.1975年由（SangerSanger法的原理1.使用带有放射性同位素的ddNTP来终止DNA合成反应2.高分辨率变性凝胶电泳以及放射自显影确定DNA序列核心原理：1.测序长度可达1000bp2.准确性高，几乎100%3.通量低，成本高，耗时长，不适合大规模应用特点：Sanger法核心原理3Sanger法的原理1.使用带有放射性同位素的ddNTP来终第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。随着人类基因组计划的完成,人们进入了后基因组时代,即功能基因组时代,传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求,这促使了新一代DNA测序技术的诞生，即第二代测序技术。4第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用第二代基因测序技术核心原理：边合成边测序（SBS）基本步骤：文库制备—单克隆DNA簇的产生—测序反应5第二代基因测序技术核心原理：边合成边测序（SBS）基本步骤：具代表性的第二代测序平台：

1.荧光标记-美国Illumina公司的基因组测序仪（genomeanalyzer，GA）-瑞士Roche公司的454-美国ABI公司的寡聚物连接检测测序（sequencingbyoligoligationdetection，SOLiD）第二代基因测序技术2.PH变化-美国LifeTechnologies公司的IonTorrent个人化操作基因组测序仪(PGM）6具代表性的第二代测序平台：第二代基因测序技术2.PH变化6Illumina测序平台美国Illumina公司的基因组测序仪（genomeanalyzer，GA）Illumina的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器主要技术点：1.可逆终止的荧光标记dNTP2.边合成边测序7Illumina测序平台美国Illumina公司的基因组测Illumina测序平台测序原理文库构建SBS测序桥式pcrFlowcell测序原理（来自illumina官网）8Illumina测序平台测序原理文库构建SBS测序桥式pcrIllumina测序平台核心部件测序流动槽flowcell：吸附流动DNA片段的槽道，也是核心的测序反应容器——在flowcell上进行DNA簇的生成，测序。Flowcell实物图9Illumina测序平台核心部件测序流动槽flFlowcell表面示意图（来自illumina官网）每个泳道(Lane)内的上下两个表面随机的布满了能够与文库两端接头分别互补配对的寡核苷酸(P7和P5接头)。这两种接头与泳道表面共价连接。Flowcell表面微观示意图10Flowcell表面示意图（来自illumina官网）DNA文库制备AATT片段化DNA末端补平3’加A：

加一个A接头连接A完成文库构建11DNA文库制备AATT片段化DNA末端补平3’加A：加一个DNA模板杂交和一链合成5’-3’延伸接头序列含有P7和P5两种接头的FlowCell表面2.以杂交的单链DNA为模板，FlowCell上的接头为引物，合成第一链1.单链DNA分子与FlowCell表面的对应接头杂交12DNA模板杂交和一链合成5’-3’延伸接头序列含有P7和P双链DNA变性变性冲走模板链新和成的链留在flowcell上13双链DNA变性变性冲走模板链新和成的链留在flowcell上桥式PCR的扩增单链DNA与FlowCell表面对应接头杂交，形成“桥”以接头为引物进行扩增扩增完成形成双链的桥14桥式PCR的扩增单链DNA与FlowCell表面对应接头杂交双链DNA变性变性得到与FlowCell相连的两条互补的单链DNA分子15双链DNA变性变性得到与FlowCell相连的两条互补的单链待测链形成完成数十次循环的桥式PCR变性：双链“桥”变性为单链P5上的切割位点切割并冲走与P5接头相连的那条DNA链将测序引物杂交到文库的接头上，并且封闭3‘-OH端16待测链形成完成数十次循环的桥式PCR变性：双链“桥”变性为单SBS测序

特异荧光标记的4种dNTP，3’-OH叠氮基团被保护，每次只能添加一个dNTP，这就确保了在测序过程中，一次只会被添加一个碱基，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。边合成边测序（来源：illumina官网）17SBS测序特异荧光标记的4种dNTP，3’-OIonTorrentPGM半导体测序PGM测序原理芯片就是测序仪，4种dNTP依次流过半导体芯片PCRDNA聚合产生的氢离子直接检测，每个碱基只需数秒18IonTorrentPGM半导体测序PGM测序原理测序成本比较1.高通量，成本降低，敏感性高2.简单快速自动化3.读长较短50-300bq左右4.PCR可能引入偏倚跟错配如：以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周。第二代测序技术特点19测序成本比较1.高通量，成本降低，敏感性高如：第三代测序技术具代表性的第三代测序平台：

1.PacificBioscience公司的单分子实时测序(Singlemoleculerealtimesequencing，SMRT)2.OxfordNanopore的纳米孔单分子技术

第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发展和应用,但是由于其测序速度、成本、准确度等关键问题的解决仍存在困难,研究者们很快将目光转向了更高更新的测序解决方案。单分子测序也就应运而生。20具代表性的第三代测序平台：第二代的高通量测序技术OxfordNanopore纳米孔单分子技术

OxfordNanopore的纳米孔单分子技术OxfordNanopore的纳米孔单分子技术采用边解链边测序的方法。无需合成，为真正的单分子测序。当单链DNA模板会被核酸外切酶剪切成一个个碱基通过纳米孔，此时由于碱基的不同，检测到的电流强度也不同，反映出DNA模板链的碱基排布。21OxfordNanopore纳米孔单分子技术OxfordOxfordNanopore纳米孔单分子技术

MinION英国OxfoldNanoporeTechnologie公司现已推出高通量的GridION（2012年）和U盘大小的MinION（2013年）测序，它们均处于试用阶段。22OxfordNanopore纳米孔单分子技术MinION第三代测序技术特点1.在第二代基础上增加读长，达到5000bp以上，甚至数十kb2.单分子测序，样品处理简单避免了扩增可能引入的错配，准确率接近100%3.能直接对RNA和甲基化DNA序列进行测序231.在第二代基础上增加读长，达到5000bp以上，甚至数十k谢谢24谢谢24基因测序技术

蔡悦

25基因测序技术0DNA双螺旋1953中心法则1958PCR1983DNA重组技术1974遗传密码1966DNA是遗传物质19521950200019901980197019602010第一台自动测序仪1986毛细管电泳测序仪1996荧光ddNTP第一台商用自动测序仪1987化学降解法和sanger1977Illumina200637001998Solidsystem20074542005Heliscope2008Nanopore2008Smrt200926DNA双螺旋1953PCRDNA重组技术1974遗传密码19第一代基因测序技术

1977年桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础1.1975年由（Sanger）和（Coulson）开创的双脱氧链终止法

2.1977年吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）3.在sanger法基础上发展而来的各种DNA测序技术27第一代基因测序技术1.1975年由（SangerSanger法的原理1.使用带有放射性同位素的ddNTP来终止DNA合成反应2.高分辨率变性凝胶电泳以及放射自显影确定DNA序列核心原理：1.测序长度可达1000bp2.准确性高，几乎100%3.通量低，成本高，耗时长，不适合大规模应用特点：Sanger法核心原理28Sanger法的原理1.使用带有放射性同位素的ddNTP来终第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。随着人类基因组计划的完成,人们进入了后基因组时代,即功能基因组时代,传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求,这促使了新一代DNA测序技术的诞生，即第二代测序技术。29第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用第二代基因测序技术核心原理：边合成边测序（SBS）基本步骤：文库制备—单克隆DNA簇的产生—测序反应30第二代基因测序技术核心原理：边合成边测序（SBS）基本步骤：具代表性的第二代测序平台：

1.荧光标记-美国Illumina公司的基因组测序仪（genomeanalyzer，GA）-瑞士Roche公司的454-美国ABI公司的寡聚物连接检测测序（sequencingbyoligoligationdetection，SOLiD）第二代基因测序技术2.PH变化-美国LifeTechnologies公司的IonTorrent个人化操作基因组测序仪(PGM）31具代表性的第二代测序平台：第二代基因测序技术2.PH变化6Illumina测序平台美国Illumina公司的基因组测序仪（genomeanalyzer，GA）Illumina的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器主要技术点：1.可逆终止的荧光标记dNTP2.边合成边测序32Illumina测序平台美国Illumina公司的基因组测Illumina测序平台测序原理文库构建SBS测序桥式pcrFlowcell测序原理（来自illumina官网）33Illumina测序平台测序原理文库构建SBS测序桥式pcrIllumina测序平台核心部件测序流动槽flowcell：吸附流动DNA片段的槽道，也是核心的测序反应容器——在flowcell上进行DNA簇的生成，测序。Flowcell实物图34Illumina测序平台核心部件测序流动槽flFlowcell表面示意图（来自illumina官网）每个泳道(Lane)内的上下两个表面随机的布满了能够与文库两端接头分别互补配对的寡核苷酸(P7和P5接头)。这两种接头与泳道表面共价连接。Flowcell表面微观示意图35Flowcell表面示意图（来自illumina官网）DNA文库制备AATT片段化DNA末端补平3’加A：

加一个A接头连接A完成文库构建36DNA文库制备AATT片段化DNA末端补平3’加A：加一个DNA模板杂交和一链合成5’-3’延伸接头序列含有P7和P5两种接头的FlowCell表面2.以杂交的单链DNA为模板，FlowCell上的接头为引物，合成第一链1.单链DNA分子与FlowCell表面的对应接头杂交37DNA模板杂交和一链合成5’-3’延伸接头序列含有P7和P双链DNA变性变性冲走模板链新和成的链留在flowcell上38双链DNA变性变性冲走模板链新和成的链留在flowcell上桥式PCR的扩增单链DNA与FlowCell表面对应接头杂交，形成“桥”以接头为引物进行扩增扩增完成形成双链的桥39桥式PCR的扩增单链DNA与FlowCell表面对应接头杂交双链DNA变性变性得到与FlowCell相连的两条互补的单链DNA分子40双链DNA变性变性得到与FlowCell相连的两条互补的单链待测链形成完成数十次循环的桥式PCR变性：双链“桥”变性为单链P5上的切割位点切割并冲走与P5接头相连的那条DNA链将测序引物杂交到文库的接头上，并且封闭3‘-OH端41待测链形成完成数十次循环的桥式PCR变性：双链“桥”变性为单SBS测序

特异荧光标记的4种dNTP，3’-OH叠氮基团被保护，每次只能添加一个dNTP，这就确保了在测序过程中，一次只会被添加一个碱基，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。边合成边测序（来源：illumina官网）42SBS测序特异荧光标记的4种dNTP，3’-OIonTorrentPGM半导体测序PGM测序原理芯片就是测序仪，4种dNTP依次流过半导体芯片PCRDNA聚合产生的氢离子直接检测，每个碱基只需数秒43IonTorrentPGM半导体测序PGM测序原理测序成本比较1.高通量，成本降低，敏感性高2.简单快速自动化3.读长较短50-300bq左右4.PCR可能引入偏倚跟错配如：以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周。第二代测序技术特点44测序成本比较1.高通量，成本降低，敏感性高如：第三代测序技术具代表性的第三代测序平台：