2022孤立性胼胝体发育异常胎儿的系列遗传学诊断研究(全文)

2022孤立性胼胝体发育异常胎儿的系列遗传学诊断研究（全文）摘要目的从细胞遗传学、基因组及单基因水平探讨染色体核型分析、染色体微阵列分析（CMA）及全外显子测序（WES）技术在孤立性胼胝体发育异常（CCA）胎儿产前诊断中的应用价值。方法选取2010年1月至2021年4月在广州市妇女儿童医疗中心及清远市人民医院产前诊断中心就诊，超声及MRI检查诊断为孤立性CCA并行侵入性产前诊断的胎儿。对所有胎儿样本行染色体核型分析和（或）CMA［或拷贝数变异测序（CNV‑seq）］检测，对染色体核型分析和（或）CMA（或CNV‑seq）检测结果未见异常的胎儿及其父母样本进一步行WES检测。结果65例孤立性CCA胎儿中，行染色体核型分析38例，检出异常染色体核型3例，检出率为8%（3/38）。共计49例孤立性CCA胎儿行CMA（或CNV‑seq）检测，检出致病性CNV6例，检出率为12%（6/49），其中，染色体核型分析结果异常，进一步行CMA检测的检出率为1/1；染色体核型结果正常，进一步行CMA（或CNV‑seq）检测的检出率为14%（3/21）；以CMA检测为一线检测技术的检出率为7%（2/27）。共计25例染色体核型分析和（或）CMA检测结果阴性的孤立性CCA胎儿行WES检测，检出致病基因9例，检出率为36%（9/25）。染色体核型分析、CMA及WES三种检测技术的梯度遗传学诊断使26%（17/65）孤立性CCA胎儿得到明确的遗传学诊断。结论对孤立性CCA胎儿进行产前遗传学诊断具有重要的临床意义，CMA检测的检出率高于传统的染色体核型分析技术。CMA检测可作为孤立性CCA胎儿的一线检测技术，染色体核型分析和（或）CMA检测结果阴性时，WES可额外提高孤立性CCA胎儿的致病性检出率。讨论CCA最早在1812年由Reil描述［8］，男性的发病率略高于女性，在总患病人群中，男性占比为52%~56%，略高于女性［9‑10］。本研究中，男女胎儿的占比分别为66%（43/65）和34%（22/65），男性胎儿占比较文献报道略高。有报道显示，CCA是妊娠24周后胎儿因中枢神经系统畸形引产的常见原因之一，但目前为止，胎儿CCA的病因仍不明确。随着遗传学检测技术的进步，越来越多的研究提示，胎儿CCA与染色体数目或结构异常、染色体微缺失或微重复以及单基因突变等相关。另外，根据是否合并其他器官或结构畸形，CCA胎儿的预后也存在较大差异，复杂性CCA胎儿预后差，孤立性CCA胎儿的预后目前由于缺乏大样本量研究，争议较大。因此，对孤立性CCA胎儿进行遗传学病因的鉴定不仅有助于产前咨询，而且对评估其预后有极大的帮助。一、染色体病与孤立性胎儿CCA染色体核型分析技术于20世纪60年代开始应用于CCA胎儿的产前诊断，已报道的病例中与CCA相关的异常核型包括mos46，XY/47，XY，+r、46，XY，r（6）（p25q27）/45，XY，-6、46，XX，del（1）（p31.1p32.3）、46，XY，del（20）（q11.2q13.1）、45，X/46，XY、mos47，XY，+8/46，XY、47，XY，+21等。本研究中，共38例孤立性CCA胎儿行染色体核型分析，检出异常核型3例（8%），与文献报道的检出率基本一致［11］。本研究中，编号GZFE02胎儿核型结果为46，XY，der（5）（t5；11）（p15.3；q23）pat，对其双亲进行染色体核型分析发现，其父亲在5号染色体p15.3及11号染色体q23有平衡易位，因此，该胎儿的异常核型考虑是其父亲精子形成中减数分裂时发生不平衡重组导致。本研究中，通过染色体核型分析检出的3例异常核型理论上均可通过CMA检出，尤其是编号GZFE02的5号衍生染色体，仅通过染色体核型分析无法明确衍生染色体和未知来源染色体的来源及片段大小，以及片段内所包含的在线人类孟德尔遗传数据库（onlinemendelianinheritanceinman，OMIM）致病基因，需进一步行CMA检测。本研究结果提示，对于孤立CCA胎儿，可采用CMA检测作为一线检测技术。这与国际指南［12］中的推荐“当产前超声检查提示胎儿结构异常时，CMA技术可替代常规染色体核型分析技术作为孤立性CCA胎儿的一线检测方法”是一致的。二、CMA检测在CCA胎儿中的应用价值由于CMA既能检测出染色体非整倍体，又能检测出微缺失或微重复，检测样本无需培养，极大地缩短了检测时间，因此，ACOG和SMFM指南均建议CMA检测取代传统的染色体核型分析，应用于超声结构异常胎儿的产前诊断中。2007年，CMA检测开始用于诊断胎儿CCA［3］。2010年，Koehler等［13］报道了1例复杂性CCA胎儿，基于微阵列的比较基因组杂交（array‑basedcomparativegenomichybridization，aCGH）结果显示，1p31.3p32.2出现4.9Mb的微缺失。2011年，Chen等［14］报道1例复杂性CCA胎儿，aCGH结果显示1p32.3p31.1出现22.2Mb缺失。本研究中，21例孤立性CCA胎儿在染色体核型分析结果未见异常后进一步行CMA或CNV‑seq检测，结果检出了3例致病性CNV，可见，CMA检测可额外检出14%致病性CNV。此外，本研究通过CMA检测还检出了2例片段<6Mb的致病性CNV，进一步提示，CMA技术可以在染色体核型分析结果阴性的基础上提高微小致病性CNV的检出率，可以作为一线检测技术应用于孤立性CCA胎儿的检测中。但是，CMA技术也存在一定的局限性：（1）CMA检测不能检出平衡易位、倒位以及组织嵌合体；（2）部分CMA技术（如aCGH）不能检测三倍体。因此，不能完全摒弃传统的染色体核型分析技术。本研究还对1例染色体核型结构异常的孤立性CCA胎儿进行了CMA检测，不仅进一步明确了衍生染色体的来源、异常片段的大小、性质以及片段内所含的致病基因，而且通过对所发现的2个拷贝数变异片段进一步分析，发现片段内分别包含10个和62个致病基因，为进一步评估胎儿的预后提供了依据。本研究发现，CMA技术在临床中的应用弥补了传统染色体核型分析的不足，可进一步明确异常片段的大小、性质、来源以及片段内所含的致病基因，为产前咨询和胎儿预后评估提供更确切的遗传学依据。三、WES在CCA胎儿中的应用CCA是胎儿中枢神经系统常见的畸形之一。目前已有研究对娩出后的CCA新生儿进行WES检测，鉴定出了部分与CCA相关的致病基因，但是，妊娠期对CCA胎儿进行WES检测的研究较少。由于产前无法评估胎儿的智力、是否有认知功能障碍等表型，而WES的数据分析极度依赖表型，因此，在妊娠期对胎儿进行WES检测，建立并完善CCA胎儿的WES分析参考数据库具有重要的意义。本研究对25个孤立性CCA胎儿核心家系进行WES检测，发现在CMA检测结果未见明显异常的胎儿中，WES可将孤立性CCA致病性总检出率额外提高36%（9/25）。本研究中WES的额外检出率较文献报道［5］高，分析原因如下：（1）纳入胎儿的例数及人种不同：本研究中25个CCA家系行WES检测，均为孤立性CCA胎儿家系，且均为亚洲人群，而文献纳入的65个家系中，有11个为复杂性CCA，而且均为高加索人。（2）胎CCA类型占比不同：本研究行WES检测的胎儿中，完全性胼胝体缺如占比92%（23/25），而文献中纳入的完全性胼胝体缺如占比仅为43%，远低于本研究；此外，文献中还纳入了29%的短小胼胝体胎儿，而本研究中未纳入此类型。（3）纳入胎儿的入选标准不同：本研究中所有纳入的胎儿均通过胎儿头颅MRI检查进一步确诊，而文献中仅部分胎儿行MRI检查；仅靠超声检查诊断胎儿CCA存在一定的误诊率，而CCA胎儿的误诊可能会影响WES的检出率。本研究中WES在部分性胼胝体缺如胎儿中的检出率（2/2）明显高于文献报道［5］，考虑与本研究纳入的部分性胼胝体缺如胎儿例数较少有关，在今后的研究中，需增加样本量进一步研究。本研究对25例CMA检测阴性的胎儿进一步行核心家系WES检测，9例孤立性CCA胎儿中检出7个致病或可能致病基因，其中，PTDSS1基因突变为本研究首次报道和胎儿CCA相关。NFIA（c.1112C>A）、TUBB2Bc.538G>A）、ARID1B（c.316_317insTGTA）、ARID1B（c.1601_1605delACCCT）和ARX（c.975delA）基因突变位点均为本研究首次发现与胎儿CCA相关。L1CAM（c.2254G>A）及L1CAM（c.176C>T）基因突变位点为本研究首次在孤立性CCA胎儿中报道。另外，将CMA检测所得致病性CNV片段中与中枢神经系统发育相关的基因与WES检测发现的致病或可能致病基因结果结合，发现在2例及以上患儿中出现的基因有3个，分别为NFIA、L1CAM、ARID1B基因。四、随访本研究通过对活产的12例孤立性CCA新生儿进行随访，发现仅1例患儿出现精神、运动发育迟缓，提示孤立性CCA胎儿在排除遗传学病因后，大部分预后良好。五、本研究的局限性首先，本研究样本量较小，各个技术的梯度产前遗传学诊断结果难免存在偏差。其次，仍有一部分孤立性CCA胎儿未能明确病因学诊断，后续可能需要进一步开展全基因组测序（wholegenomesequencing，WGS）及表观遗传学研究。最后，本研究中仅12例孤立性CCA胎儿在行遗传学检查后活产，由于随访例数较少，可能对随访结果产生一定的影响。本研究对孤立性CCA胎儿进行了从细胞遗传到分子遗传层面系统、全面的遗