生产菌种的扩大培养与保藏培训课程

第六章生产菌种的扩大培养与保藏1定义种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。2作为种子的准则菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；生理形状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染；保持稳定的生产能力。3本章讲述的内容第一节种子的制备过程第二节种子质量的控制第三节实例第四节菌种的保藏与复壮4第一节种子的制备过程种子制备的过程大致可分为：实验室种子制备阶段生产车间种子制备阶段5一、实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。6（一）孢子的制备1，细菌孢子的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37˚C。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。72，霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28˚C。培养时间一般为4~14天。83，放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28˚C。培养时间为5~14天。9（二）液体种子制备1，好氧培养：对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S.griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S.Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。试管→三角瓶→摇床→种子罐102，厌氧培养养：对于酵酵母菌（啤啤酒，葡萄萄酒，清酒酒等）试管→三角角瓶→卡式式罐→种子子罐11二、生产车车间种子制制备实验室制备备的孢子或或液体种子子移种至种种子罐扩大大培养，种种子罐的培培养基虽因因不同菌种种而异，但但其原则为为采用易被被菌利用的的成分如葡葡萄糖、玉玉米浆、磷磷酸盐等，，如果是需需氧菌，同同时还需供供给足够的的无菌空气气，并不断断搅拌，使使菌（丝））体在培养养液中均匀匀分布，获获得相同的的培养条件件。121，种子罐的的作用：主要是使孢孢子发芽，，生长繁殖殖成菌（丝丝）体，接接入发酵罐罐能迅速生生长，达到到一定的菌菌体量，以以利于产物物的合成。。132，种子罐级级数的确定定种子罐级数数：是指制制备种子需需逐级扩大大培养的次次数，取决决于：菌种生长特特性、孢子子发芽及菌菌体繁殖速速度；所采用发酵酵罐的容积积14细菌：生长长快，种子子用量比例例少，级数数也较少，，二级发酵酵。茄子瓶→种种子罐→发发酵罐霉菌：生长长较慢，如如青霉菌，，三级发酵酵孢子悬浮液液→一级种种子罐（27˚C,40小时孢子发发芽，产生生菌丝））→二级种种子罐（27˚C,10~24小时，菌体体迅速繁殖殖，粗壮菌菌丝体）→→发酵罐放线线菌菌：：生生长长更更慢慢，，采采用用四四级级发发酵酵酵母母：：比比细细菌菌慢慢，，比比霉霉菌菌，，放放线线菌菌快快，，通通常常用用一一级级种种子子15确定定种种子子罐罐级级数数需需注注意意的的问问题题种子子级级数数越越少少越越好好，，可可简简化化工工艺艺和和控控制制，，减减少少染染菌菌机机会会种子子级级数数太太少少，，接接种种量量小小，，发发酵酵时时间间延延长长，，降降低低发发酵酵罐罐的的生生产产率率，，增增加加染染菌菌机机会会虽然然种种子子罐罐级级数数随随产产物物的的品品种种及及生生产产规规模模而而定定。。但但也也与与所所选选用用工工艺艺条条件件有有关关。。如如改改变变种种子子罐罐的的培培养养条条件件，，加加速速了了孢孢子子发发芽芽及及菌菌体体的的繁繁殖殖，，也也可可相相应应地地减减少少种种子子罐罐的的级级数数。。16第二二节节种种子子质质量量的的控控制制一、、影影响响孢孢子子质质量量的的因因素素及及控控制制培养养基基培养养条条件件培养养时时间间和和冷冷藏藏时时间间171，培培养养基基生产产过过程程中中经经常常出出现现种种子子质质量量不不稳稳定定的的现现象象，，其其主主要要原原因因是是原原材材料料质质量量波波动动。。例如如在在四四环环素素、、土土霉霉素素生生产产中中，，配配制制产产孢孢子子斜斜面面培培养养基基用用的的麸麸皮皮，，因因小小麦麦产产地地、、品品种种、、加加工工方方法法及及用用量量的的不不同同对对孢孢子子质质量量的的影影响响也也不不同同。。蛋白白胨胨加加工工原原料料不不同同如如鱼鱼胨胨或或骨骨胨胨对对孢孢子子影影响响也也不不同同。。原材材料料质质量量的的波波动动，，起起它它要要作作用用的的是是其其中中无无机机离离子子含含量量不不同同，，如如微微量量元元素素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺刺激激孢孢子子的的形形成成。。磷磷含含量量太太多多或或太太少少也也会会影影响响孢孢子子的的质质量量。。18水质的影响：：地区不同、、季节变化和和水源污染，，均可造成水水质波动，影影响种子质量量。菌种在固体培培养基上可呈呈现多种不同同代谢类型的的菌落，氮源源品种越多，，出现的菌落落类型也越多多，不利于生生产的稳定。。19措施培养基所用原原料要经过发发酵试验合格格才可使用严格控制灭菌菌后培养基的的质量斜面培养基使使用前，需在在适当温度下下放置一定时时间供生产用的孢孢子培养基要要用比较单一一的氮源，作作为选种或分分离用的培养养基则采用较较复杂的有机机氮源202，培养条件（1）温度温度对多数品品种斜面孢子子质量有显著著的影响。如如土霉素生产产菌种在高于于37˚C培养时，孢子子接入发酵罐罐后出现糖代代谢变慢，氨氨基氮回升提提前，菌丝过过早自溶，效效价降低等现现象。一般各各生产单位都都严格控制孢孢子子斜面的的培养温度。。21（2）湿度制备斜面孢子子培养基的湿湿度对孢子的的数量和质量量有较大的影影响。例如土土霉素生产菌菌种龟裂链霉霉菌，孢子制制备时发现：：在北方气候候干燥地区孢孢子斜面长得得较快，在含含有少量水分分的试管斜面面培养基下部部孢子长得较较好，而斜面面上部由于水水分迅速蒸发发呈干疤状，，孢子稀少。。在气温高含含湿度大的地地区，斜面孢孢子长得慢，，主要由于试试管下部冷凝凝水多而不利利于孢子的形形成。从表中中看出相对湿湿度在40%~45%时孢子数量最最多，且孢子子颜色均匀，，质量较好。。相对湿度（%）斜面外观活孢子计数(亿/支)16.5-1925-3640-45上部稀薄,下部略黄上部薄,中部均匀发白一片白,孢子丰富1.22.35.7不同相对湿度度对龟裂链霉霉菌斜面生长长的影响223，培养时间和和冷藏时间（1）培养时间一般来说，衰衰老的孢子不不如年轻的孢孢子，因为衰衰老的孢子已已在逐步进入入发芽阶段，，核物质趋于于分化状态。。过于衰老的的孢子会导致致生产能力的的下降。措施：孢子培培养的时间应应该控制在孢孢子量多、孢孢子成熟、发发酵产量正常常的阶段终止止培养。23（2）冷藏时间斜面冷藏对孢孢子质量的影影响与孢子成成熟程度有关关。如土霉素素生产菌种孢孢子斜面培养养4天左右即于4˚C冰箱保存，发发现冷藏7~8天菌体细胞开开始自溶。而而培养5天以后冷藏，，20天未发现自溶溶。冷藏时间对孢孢子的生产能能力也有影响响。例如在链链霉素生产中中，斜面孢子子在6˚C冷藏两个月后后的发酵单位位比冷藏一个个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。244，接种量接种量大小影影响到培养基基中孢子的数数量，进而影影响菌体的生生理状况。25二、影响种子子质量的因素素及控制孢子的质量培养基培养条件种龄接种量261，培养基营养成分适合合种子培养的的需要选择有利于孢孢子发芽和菌菌体生长的培培养基；营养上要易于于被菌体直接接吸收和利用用；营养成分要适适当丰富和完完全，氮源和和维生素含量量要高营养成分要尽尽可能与发酵酵培养基相近近。272，培养条件（1）温度（2）通气量在种子罐中培培养的种子除除保证供给易易被利用的培培养基外，有有足够的通气气量可以提高高种子质量。。例如，青霉霉素的生产菌菌种在制备过过程中将通气气充足和不足足两种情况下下得到的种子子分别接入发发酵罐内，它它们的发酵单单位可相差1倍。但也有例例外，例如土土霉素生产菌菌，一级种子子罐的通气量量小对发酵有有利。283，种龄种龄：是指种种子罐中培养养的菌丝体开开始移入下一一级种子罐或或发酵罐时的的培养时间。。通常种龄是以以处于生命力力极旺盛的对对数生长期，，菌体量还未未达到最大值值时的培养时时间较为合适适。时间太长长，菌种趋于于老化，生产产能力下降，，菌体自溶；；种龄太短，，造成发酵前前期生长缓慢慢。不同菌种或同同一菌种工艺艺条件不同，，种龄是不一一样的，一般般需经过多种种实验来确定定。嗜碱性芽芽孢杆菌生产产碱性蛋白酶酶，12小时最好。294，接种量接种量：是指指移入的种子子液体积和接接种后培养液液体积的比例例。接种量的大小小决定于生产产菌种在发酵酵罐中生长繁繁殖的速度，，采用较大的的接种量可以以缩短发酵罐罐中菌丝繁殖殖达到高峰的的时间，使产产物的形成提提前到来，并并可减少杂菌菌的生长机会会。但接种量量过大或者过过小，均会影影响发酵。过过大会引起溶溶氧不足，影影响产物合成成；而且会过过多移入代谢谢废物，也不不经济；过小小会延长培养养时间，降低低发酵罐的生生产率。通常接种量，，细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有时20~25%30三、种子质量量的控制措施施种子质量的最最终指标是考考察其在发酵酵罐中所表现现出来的生产产能力。因此此首先必须保保证生产菌种种的稳定性，，其次是提供供种子培养的的适宜环境保保证无杂菌侵侵入，以获得得优良种子。。菌种稳定性的的检查无（杂菌）检检查31四、种子质量量标准1，细胞或菌体体菌丝形态、菌菌丝浓度和培培养液外观（（色素、颗粒粒等）单细胞：菌体体健壮、菌形形一致、均匀匀整齐，有的的还要求有一一定的排列或或形态；霉菌、放线菌菌：菌丝粗壮壮、对某些染染料着色力强强、生长旺盛盛、菌丝分枝枝情况和内含含物情况好。。322，生化指标种子液的糖、、氮、磷的含含量和pH变化。333，产物生成量量在抗生素发酵酵中，产物生生成量是考察察种子质量的的重要指标，，因为种子液液中产物生成成量的多少间间接反映种子子的生产能力力和成熟程度度。344，酶活力种子液中某种种酶的活力，，与目的产物物的产量有一一定的关联。。35第三节实实例一、谷氨酸发发酵的菌种扩扩大培养斜面菌种→一级种子培养养→二级种子培养养→发酵罐1，斜面菌种的的培养菌种的斜面培培养必须有利利于菌种生长长而不产酸，，并要求斜面面菌种绝对纯纯，不得混有有任何杂菌和和噬菌体，培培养条件应有有利于菌种繁繁殖，培养基基以多含有机机氮而不含或或少含糖为原原则。(1)斜面培养基组组成葡萄糖0.1％蛋蛋白陈1.0％牛牛肉膏1.0％氯氯化钠0.5％琼琼脂2.0~2.5％PH7.0~7.2（传代和保藏藏斜面不加葡葡萄糖）(2)培养条件：33~34℃℃，培养18~24h362，一级种子子培养一级种子培养养的目的在于于大量繁殖活活力强的菌体体，培养基组组成应以少含含糖分，多含含有机氮为主主，培养条件件从有利于长长菌考虑。(1)培养基基组成成葡萄糖糖2.5％尿尿素素0.5％硫酸镁镁0.04％磷磷酸酸氢二二钾0.1％玉米浆浆2.5~3.5％(按质增增减)硫酸亚亚铁、、硫酸酸锰各各2ppmpH7.037(2)培养条条件用用1000mL三角瓶瓶装入入培养养基200mI，灭菌菌后置置于冲冲程7．6cm、频率率96次／min的往复复式摇摇床上上振荡荡培养养12h，培养养温度度33~34℃(3)一级种种子质质量要要求种龄：：12hpH值：6.4±0.1光密度度：净净增OD值0.5以上残糖：：0.5％以下下无无菌菌检查查：(-)噬菌体体检查查：(-)镜检：：菌体体生长长均匀匀、粗粗壮，，排列列整齐齐革兰氏氏阳性性反应应。383，二二级种种子培培养为了获获得发发酵所所需要要的足足够数数量的的菌体体，在在一级级种子子培养养的基基础上上进而而扩大大到种种子罐罐的二二级种种子培培养。。种子子罐容容积大大小取取决于于发酵酵罐大大小和和种量量比例例。(1)培养基基组成成39(2)培养条条件接种量量：0.8~1.0％培养温温度：：32~34℃培养时间间：7~8h通风量50L种子罐1:0.5搅拌转速速340r／min；250L种子罐1:0.3搅拌转速速300r／min500L种子罐1:0.25搅拌转速速230r／min40(3)二级种子子的质量量要求种龄7~8hpH7.2左右OD值净净增增0.5左右无菌检查查(-)噬菌体检检查(-)41二、啤酒酒酵母的的扩大培培养一般可采采用三级级扩大培培养，扩扩大倍数数：第1级到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。1，实验室室扩大培培养422，车间扩扩大培养养43第四节菌菌种的的保藏与与复壮一、菌种种保藏的的意义菌种是从从事微生生物学以以及生命命科学研研究的基基本材料料，特别别是利用用微生物物进行有有关生产产如抗生生素、氨氨基酸、、酿造等等工业，，更离不不开菌种种。所以以菌种保保藏是进进行微生生物学研研究和微微生物育育种工作作的重要要组成部部分。其其任务首先是使使菌种不不致死亡亡，同时时还要尽尽可能设设法把菌菌种的优优良特性性保持下下来而不不致向坏坏的方面面转化。。44二、菌种种保藏的的原理菌种保藏藏主要是是根据菌菌种的生生理生化化特点人人工创造造条件使使孢子或或菌体的的生长代代谢活动动尽量降降低，以以减少其其变异。。一般可可通过保保持培养养基营养养成分在在最低水水平缺氧氧状态，