药物定量分析与分析方验证

第四章

药物定量分析与分析方验证

样品前处理

分析样品前处理

采用一定的方法,使待测药物或待测元素转化为适宜的状态后,再进行分析测定．第四章第一节定量分析样品的前处理方法

样品前处理

前处理对象以上药物在进行鉴别、检查及含量测定前,需要经过不同方法处理后,方可进行测定.第四章1.含卤素元素（F、Cl、Br、I）2.金属元素（Ca、Fe、Hg、Zn、Sn

、Bi)3.含As、P、S等元素4.生物样本第一节定量分析样品的前处理方法

样品前处理

前处理样品分类有机卤素药物1卤素与脂肪链的碳原子相连结合不牢固2卤素与芳环相连结合牢固第四章

1金属离子不直接与碳原子相连

在溶液中可直接离解出金属离子.2金属离子直接与碳原子以共价键相连.结合状态比较牢固,在溶液中不能直接离解出金属离子.含金属有机药物第一节定量分析样品的前处理方法

样品前处理

根据卤素或金属在分子中结合牢固程度不同处理方法而异.第四章不经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法直接测定法经水解后测定法经氧化还原后测定法湿法破坏法干法破坏法氧瓶燃烧法前处理方法第一节定量分析样品的前处理方法

样品前处理

第四章1直接测定法2经水解后测定法3经氧化还原后测定法不经有机破坏的分析方法第一节定量分析样品的前处理方法

样品前处理

（1）金属离子不直接与碳原子相连第四章乳酸钙1直接测定法

例1：乳酸钙含量测定

0.3g+水100ml放冷+NaOH15mlEDTA滴定钙紫红素指示剂第一节定量分析样品的前处理方法

样品前处理

第四章(2)金属离子直接与碳原子以共价键相连富马酸亚铁

例2：富马酸亚铁含量测定富马酸亚铁溶于热硫酸,同时分解释放出亚铁离子,可选用铈量法进行测定.邻二氮菲为指示剂.第一节定量分析样品的前处理方法

适用于卤素原子与脂肪链的碳原子相连,结合不牢固药物.CCl3—C(CH3)2—OH三氯叔丁醇

不经有机破坏的方法

第四章2经水解后测定法第一节定量分析样品的前处理方法

将含卤素的有机药物溶于适当溶剂（如乙醇）中,加氢氧化钠溶液或硝酸银溶液后,加热回流使其水解,将有机结合的卤素,经水解作用转变为无机的卤素离子,然后选用间接银量法进行测定.

不经有机破坏的方法

第四章（1）直接回流后测定法第一节定量分析样品的前处理方法①三氯叔丁醇CCl3—C(CH3)2—OH

+NaOH

(CH3)2

CO+NaCl+HCOONa

NaCl+AgNO3AgCl↓+NaNO3

AgNO3+NH4SCNAgSCN+NH4NO3第四章②六氯对二甲苯（Hexachloro-p-xylene）

+6AgNO3+6H2O

加入AgNO3加热回流完全后,可用硫氰酸铵标准溶液直接滴定剩余的硝酸银,以求得含量.第四章

不经有机破坏的方法

第四章

硬脂酸镁与定量硫酸共沸、水解生成硬脂酸和硫酸镁,剩余的酸以氢氧化钠滴定.

Mg(C17H35COO)2+H2SO4MgSO4+2C17HCOOHH2SO4+NaOHNa2SO4+H2O

适用于金属原子与脂肪链的碳原子相连,结合不牢固药物.（2）用硫酸水解后测定法第一节定量分析样品的前处理方法

不经有机破坏的方法

3经氧化还原后测定法（1）碱性还原后测定

卤素结合于芳环上,由于分子碘的结合较牢固,需在碱性溶液中加还原剂（如锌粉）,加热回流,使碳-碘键断裂,形成无机碘化物后测定.第四章第一节定量分析样品的前处理方法泛影酸（卤素原子与芳环相连,化学键牢固）+3NaI+2CH3COONa+3Na2ZnO2+3H2O第四章Zn粉NaI+AgNO3AgI

+NaNO3曙红钠为吸附指示剂黄色玫瑰红色

不经有机破坏的方法

（2）酸性还原后测定在醋酸酸性条件下加还原剂锌粉,加热回流,使碳-碘键断裂,形成无机碘化物后用银量法测定.如：碘番酸含量测定第四章第一节定量分析样品的前处理方法

不经有机破坏的方法

（3）利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量含锑药物Sb5+具有氧化性,在酸性下氧化KI定量析出I2，可用Na2S2O3

滴定.第四章例如：葡萄糖锑钠

Sb5++2KISb3++I2

I2+2Na2S2O32NaI+2Na2S4O6

第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法

有机卤素及金属的药物结构中的卤素或金属离子与碳原子结合牢固者,用上述方法难以成为无机的化合物,此时必须采用有机破坏的方法,使之转变为无机化合物,方可进行测定.第四章有机破坏方法第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法

有机破坏方法1湿法破坏法2干法破坏法3氧瓶燃烧法第四章第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法1湿法破坏法

第四章③硝酸-硫酸法－适于大多数有机物质破坏②硫酸-硫酸盐法－常用于含砷、锑有机药物

①硝酸-高氯酸法－破坏力强,不适于含氮杂环第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法注意事项1取样量—含金属元素在10~100g

范围内,取样10g

生物样品—血10

~15ml;尿50ml2所用仪器凯氏烧瓶3空白试验4

通风橱中进行第四章第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法

第四章

——适用于含氮杂环,不适于含汞、砷药物的测定.2

干法破坏将有机物灼烧灰化以达到分解目的.

常加无水碳酸钠或轻质氧化镁以助灰化.第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法

第四章

1应控制温度420℃以下注意事项

2灰化完全第一节定量分析样品的前处理方法3氧瓶燃烧法经有机破坏的方法氧瓶燃烧法是将有机药物放入充满氧气的密闭烧瓶中进行燃烧,并将燃烧所产生的欲测物质（气态）吸收于适当吸收液中,然后根据欲测物质的性质,采用适当分析方法进行鉴别、检查或含量测定.第四章第一节定量分析样品的前处理方法特点经有机破坏的方法①快速分解有机药物的简单方法.②不需复杂设备,能使有机结合中的待测元素定量地分解成无机离子状态.第四章③适用于含卤素及硫、磷、硒等药物的鉴别、检查和含量测定,特别适用于微量样品的测定.第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法（3）仪器装置第四章第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法

容量大小随样品量而定,一般500ml、1000ml.

※

含氟药物用石英制或聚氯乙烯制的燃烧瓶,因样品燃烧后,产生HF,对玻璃有腐蚀作用,与玻璃中的硼生成氟化硼,BF3在水中不能完全解离,而使测定结果偏低.第四章①硬质玻璃碘瓶第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法铂丝下端做成螺旋状,长度约为瓶身的2/3.铂丝作用

a固定样品

b催化－使样品分解完全第四章②瓶塞底部熔封一根铂丝第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法操作②加吸收液﹑通氧③燃烧④吸收⑤测定①取样10-20mg第四章第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法注意事项

①充氧气要充分

使样品燃烧完全,一般急速通氧气1~2分钟,燃烧完全时没有黑色炭化物.第四章第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法②吸收完全一般振摇30’,燃烧瓶看不到烟雾.Cl－、F－白色烟雾Br－棕色I－紫色第四章第一节定量分析样品的前处理方法吸收液的选择

氟水氯NaOH溶液溴H2O2-NaOH

NaOH-硫酸肼饱和溶液碘NaOH水溶液或NaOH－硫酸肼饱和溶液硫NaOH或H2O2

硒硝酸溶液

经有机破坏的方法③防爆

样品燃烧时,温度很高,燃烧瓶内压力很大,有爆炸的可能性,必须采取防护措施.防护措施戴防护眼睛瓶外包湿毛巾第四章第一节定量分析样品的前处理方法④空白试验经有机破坏的方法卤素化合物的燃烧产物①氟化物、氯化物

氟或氯以离子状态存在,吸收后可直接测定.第四章第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法②溴化物③碘化物溴化物或碘化物,燃烧后以多种价态存在,吸收后应转化为统一价态再测定.第四章第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法（七）实例-碘苯酯的含量测定第四章燃烧吸收加溴加甲酸加KI

滴定

第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法第四章将І

-、І

2氧化为ІO3

2NaІ+Br2=2NaBr+І

2

І

2+5Br2+6H2O=2HІO3

+10HBr3加甲酸：除去过量的溴2溴-醋酸氧化剂：І

2+2Na2S203

2HNaІ

+Na2S4034加KI

滴定

K

І+І

O3

3І

2+H2OR-ІCO2+H2O+NaІ+І2+NaІO3+NaCl1燃烧吸收O第一节定量分析样品的前处理方法经有机破坏的方法第四章将І

-、І

2氧化为ІO3

2NaІ+Br2=2NaBr+І

2

І

2+5Br2+6H2O=2HІO3

+10HBr3加甲酸：除去过量的溴2溴-醋酸氧化剂：І

2+2Na2S203

2HNaІ

+Na2S4034加KI

滴定

K

І+І

O3

3І

2+H2OR-ІCO2+H2O+NaІ+І2+NaІO3+NaCl1燃烧吸收O第一节定量分析样品的前处理方法容量分析法第二节定量分析方法特点

容量法的特点简便、快速、比较准确，所用仪器普通易得，在药品检验中具有很大的使用价值。第四章容量分析法第二节定量分析方法特点基本术语1，滴定：将滴定剂通过滴管滴入待测溶液中的过程2，滴定剂：浓度准确已知的试样溶液3，指示剂：滴定分析中能发生颜色改变而指示终点的试剂4，滴定终点：滴定分析中指示剂发生颜色改变的那一点（实际）5，化学计量点：滴定剂与待测溶液按化学计量关系反应完全的那一点（理论）6，滴定误差：滴定终点与等当点不一致产生的误差第四章容量分析法第二节定量分析方法特点2．容量分析的计算问题（1）滴定度的定义：每1ml某摩尔浓度的滴定液所相当的被测药物的重量。中国药典用mg表示。（2）滴定度（T）的计算：在容量分析中，被测物质（B）与标准溶液（A）之间都按一定的摩尔比进行反应的，反应可表示为：第四章容量分析法第二节定量分析方法特点（2）百分含量的计算①直接滴定法：含量%=V×T/W×100%②间接滴定法：不做空白试验时百分含量计算

做空白试验时百分含量计算

含量%=（V空白—VB）×T×F/W×100%第四章光谱分析法第二节定量分析方法特点1．紫外-可见分光光度法特点灵敏度高，可达10-4g/ml～10-7g/ml.准确度高，相对误差为2%～5%。仪器价格较低廉，操作简单，易于普及。应用广泛。第四章光谱分析法第二节定量分析方法特点朗伯-比耳定律式中：A为吸收度，l为液层厚度，C为溶液浓度，E为吸收系数。E（吸收系数）：单位液层厚度时的吸收度。有两种表示方法：摩尔吸收系数：在一定波长下，溶液浓度为1mol/L，厚度为1cm时的吸收度。用ε表示。百分吸收系数：在一定波长下，溶液浓度为1%（W/V），厚度为1cm时的吸收度。用表示。第四章光谱分析法第二节定量分析方法特点两者之间的关系：或ε的大小反映了物质对光的吸收能力，也反映测定的灵敏度。ε达104为强吸收102～104为中吸收＜102为弱吸收吸收度读数范围0.3～0.7第四章光谱分析法第二节定量分析方法特点3，含量测定的几种方法（1）对照品比较法

D为稀释倍数。第四章光谱分析法第二节定量分析方法特点3，含量测定的几种方法（2）吸收系数法p93应用示例（3）计算分光光法第四章光谱分析法第二节定量分析方法特点第四章

（二）荧光分析法特点灵敏度高，可达10-10g/ml～10-12g/ml.浓度太大会有“自熄灭”作用，故适用于低浓度的溶液。灵敏度高，干扰因素多，须做空白试验。衍生化试剂提高了适用范围取样少，方法快速。色谱分析法第二节定量分析方法特点根据分离原理分为：吸附色谱，分配色谱，离子交换色谱与排阻色谱。根据分离方法分为：纸色谱法，薄层色谱法，柱色谱法，气相色谱法，高效液相色谱法。特点：高选择性、高效能、高速度、应用广泛。高灵敏度10-12-10-15g/ml，HPLC法第四章色谱分析法第二节定量分析方法特点（一）HPLC法系统适用性试验

1，色谱柱的理论塔板数

2，分离度＞1.53，重复性对照液，连续进样5次，RSD≤2.0%4，拖尾因子d1为极大峰至峰前沿之间的距离。T应在0.95～1.05之间。第四章色谱分析法第二节定量分析方法特点（二）GC法第四章小结

1、概述本类药物的结构特征与分析方法之间的关系。

2、不经有机破坏的分析方法：（1）直接测定法。（2）经水解后测定法。（3）经氧化还原后测定法。3、经有机破坏的分析方法：（1）湿法破坏。（2）干法破坏。（3）氧瓶燃烧法。4、容量分析法

容量分析法的特点

容量分析法的计算

5、光谱分析法

紫外-可见分光光度法的特点及含量测定

荧光分析法的特点

6、色谱分析法

高效液相色谱法（系统适用性试验）气相色谱法

4.氧瓶燃烧法可用于A.含卤素有机药物的含量测定B.醚类药物的含量测定C.检查甾体激素类药物中的氟D.检查甾体激素类药物中的硒E.芳酸类药物的含量测定练习题1.氧瓶燃烧法中的装置有A.磨口硬质玻璃锥形瓶B.磨口软质玻璃锥形瓶C.铂丝D.铁丝E.铝丝（A,C）2．选择氧瓶燃烧法所必备的实验物品A.磨口硬质玻璃锥形瓶B.铂丝C.普通滤纸D.氢气E.无灰滤纸(A,B,E)3．氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为A.H2O2溶液B.H2O2—NaOH溶液C.NaOH溶液D.硫酸肼饱和液E.NaOH—硫酸肼饱和液(A,C,D)(C)思考题

1，简述氧瓶燃烧法测定药物的实验过程。2，简述色谱系统适用性试验。

一、目的二、用途三、需验证分析的项目四、验证内容第三节药品质量标准分析方法验证（药典附录XIXA收载）

目的

证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，第四章第三节药品质量标准分析方法验证用途

（一）药品质量标准起草时，分析方法需经验证。（二）药物合成方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，分析方法需经验证。

方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。第四章第三节药品质量标准分析方法验证验证分析项目1鉴别试验、杂质定量或限度检查.

2原料药或制剂中有效成分含量测定.

3制剂中其他成分（降解产物、防腐剂等）的测定.4药品溶出度、释放度等功能检查.第四章第三节药品质量标准分析方法验证验证内容1准确度2精密度3专属性4检测限5定量限6线性7范围8耐用性第四章第三节药品质量标准分析方法验证一准确度准确度

(accuracy)

指用该方法测定的结果与真实值接近的程度.

一般以回收率表示.要求：RSD≮2%

回收率98102%（UV、HPLC、GC)

99.7100.3%（容量法）体内药物分析80120%第四章第三节药品质量标准分析方法验证一准确度准确度

(accuracy)测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。

回收试验空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M第四章第三节药品质量标准分析方法验证一准确度准确度

(accuracy)加样回收试验已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为

第四章第三节药品质量标准分析方法验证数据要求二精密度在规定的测试条件下,同一个均匀样品经多次测定所得结果彼此符合程度.以标准差SD或相对标准差RSD表示.方法的精密度以三种形式表达.1重现性2中间精密度3重复性第四章第三节药品质量标准分析方法验证二精密度

指在不同实验室由不同分析者测定结果的精密度.

(药典分析方法的建立）第四章1重现性(reproducibility)第三节药品质量标准分析方法验证二精密度2中间精密度指同一实验室,不同的时间由不同分析者或使用不同的仪器进行测定的结果的精密度.第四章第三节药品质量标准分析方法验证二精密度3

重复性(repeatability)在相同条件,由一个分析者测定所得结果的精密度.第四章第三节药品质量标准分析方法验证二精密度精密度试验结果的RSD允许数值:

容量分析法≤0.2%;

重量分析法≤0.5%;

氧瓶燃烧法≤0.5%;

紫外分析法≤1%;

HPLC、GC分析法≤2%;

TLC分析法≤2%。第四章第三节药品质量标准分析方法验证专属性(specifity)

能准确并专一测出被测物的能力.是在分析复杂样品混合物时衡量其是否受到干扰及其程度的一种方法.三专属性

药物分析中考虑:杂质、降解产物、相关物质、制剂辅料.生物药物分析中考虑:内源性物质干扰,代谢产物的干扰,同时服药时的干扰.第三节药品质量标准分析方法验证1．鉴别反应应能与可能共存的物质或结构相似化合物区别，不含被分析的样品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均应呈负反应。

2．含量测定和杂质测定色谱法和其他方法，应附代表性图谱，亦说明专属性。图中应标明各组份的位置，色谱法中的分离度应符合要求。

四检测限

检测限

(limitofdetection,LOD)

指试样中被测物能被测出的最低量.第四章第三节药品质量标准分析方法验证方法与仪器的灵敏度和噪音关系样品处理后空白值的高低

1非仪器分析目视法

用已知浓度的被测物试验出能被可靠地检测出最低浓度或量.四检测限第四章2仪器分析信噪比法

用于能显示基线噪音的分析方法.以3倍信噪比（S/N=3)相对应浓度确定检测限量.第三节药品质量标准分析方法验证

数据要求定量限(limitofquantitation,LOQ)指样品中被测物能被定量测定的最低量.（应具有一定的准确度和精密度）五定量限确定方法:

信噪比法

S/N=10第四章第三节药品质量标准分析方法验证

低浓度时的可靠程度线性(linearity)

指在一定的浓度范围内,测试结果与供试物浓度呈正比关系的程度.

六线性第四章方法

用作图法或计算回归方程建立.Y=ax+br=0.9999浓度应包括一定梯度的5-8个浓度.对于含量测定要求浓度上限为样品最高浓度的120%,下限为样品最低浓度的80%,但应高于LOQ.第三节药品质量标准分析方法验证UV法：要求浓度点为n=5；吸收度A一般在0.3～0.7；相关系数r=0.9999。

HPLC法：要求浓度点为n=5～7；相关系数r=0.9999。

七线性范围

指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。

第四章原料药和制剂含量测试浓度80%~120%制剂含量均匀度测试浓度70%~130%溶出度或释放度的溶出量限度±20%

第三节药品质量标准分析方法验证耐用性(robusness)目的为常规检验提供依据.

体现耐用性因素：被测溶液的稳定性样品提取次数、时间、试剂来源流动相的组成，不同品牌的色谱柱等八耐用性第四章

指在测定条件有小的变动时,分析相同样品所测得的试验结果的重现程度.第三节药品质量标准分析方法验证

不同分析方法对验证参数的要求

验证项目鉴别杂检溶释出放度度含量测定生物样品测定定量限度精密度-+-+++准确度-+-+++检测限--+--+定量限-+---+专属性++++++线性范围-+-+++重复性-+-+++耐用性++++++第四章1

用于鉴别方法

专属性耐用性

2用于原料药中主成分或制剂中有效成分含量测定方法除不需检测限、定量限外其余6项验证方法应用3原料药中杂质测定或制剂中降解产物等其他杂质测定方法用于定量-除检测限外其余7项用于限度检查-专属性耐用性检测限第四章第三节药品质量标准分析方法验证第四节生物样品分析方法的基本要求一、常用样品的种类、采集和贮藏

二、生物样品分析前处理技术

三、定量分析方法验证第四节生物样品分析方法的基本要求一生物样品的种类第四章生物样本：生物体的任何脏器、组织、体液均可作为生物样本.常用样本:

血液（血浆、血清或全血）、尿液、唾液、毛发血样：血浆(plasma)、血清(serum)

唾液(saliva)尿液(urine)其它：乳汁、动物脏器组织匀浆等。

一、常用样品的种类、采集和贮藏二生物样品的处理1血浆或血清样品处理第四章适用：有机药物药动学研究、生物利用度测定、治疗药物检测等方法：（１）去蛋白质

（２）分离纯化浓集（３）仪器分析第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理（1）去蛋白质第四章

①加入与水混溶的有机溶剂

——蛋白质脱水沉淀

加入水溶性的有机溶剂；可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1∶（1～3）时，就可以将90％以上的蛋白质除去。

第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理（1）去蛋白质第四章

②加入中性盐

——“盐析”沉淀蛋白质

第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理第四章

③加入强酸

——与蛋白质阳离子(铵基)形成不溶性盐沉淀

④加入重金属盐

——与蛋白质阴离子(羧基)形成不溶性盐沉淀第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理第四章

⑤超滤法

—半透膜滤除可溶性生物大分子

⑥酶水解法

——蛋白分解酶分解蛋白质

⑦加热法

——蛋白质变性凝固第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理

①液-液萃取法（LLE)

多数药物是亲脂性的，在适当的溶剂中的溶解度大于水相中的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后作为分析用样品。

第四章

（3）分离纯化与浓集第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理①液-液萃取法（liquid-liquidextraction;LLE)

多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质。

第四章

（3）分离纯化与浓集第四节生物样品分析方法的基本要求

应用本法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH值等。

对所选用的有机溶剂，要求对被测组分的溶解度大：沸点低，易于浓集、挥散；与水不相混溶以及无毒、化学稳定、不易乳化等。最常用的溶剂是乙醚和氯仿等。

提取时所用的有机溶剂要适量。一般有机相与水相（体液样品）容积比为1:1或2:1。

生物样品一般多在碱性下提取，多数药物是亲脂性的碱性物质，生物样品中的内源性物质多是酸性的。

当碱性药物在碱性pH不稳定时，则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取。优点：选择性强缺点：极性化合物不适用，乳化现象二生物样品的处理第四节生物样品分析方法的基本要求第四章二生物样品的处理

②

固-相萃取(ＬＳＥ)

液－固提取法是近十几年来在纯化生物样品时被广泛采用的方法。也可以认为是规模缩小的柱色谱法。这种方法是应用液相色谱法原理处理样品。将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱，以溶剂淋洗后，将生物样品通过，使其药物或杂质保留在担体上，用适当溶剂洗去杂质，再用适当溶剂将药物洗脱下来。

第四章

（3）分离纯化与浓集第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理

②

固-相萃取(ＬＳＥ)SPE常用于填充柱的担体大致分为两类第一类为亲水性的硅藻土等第二类常用疏水性的活性炭、聚苯乙烯或Ｃ１８化学键硅胶等

第四章

（3）分离纯化与浓集第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理第四章（3）分离纯化与浓集第四节生物样品分析方法的基本要求

LSE具有优点：LSE较少引入杂质；消除了LLE的主要缺陷—乳化现象；提取效率高，可用少量生物样品进行分析；柱为可弃型，废弃物易从实验室移走；在最后洗脱中多数采用以水为主的溶剂系统，大大增加了安全性；最大的优点为处理样品速度快，并在室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定的药物。二生物样品的处理

③

被测组分浓集

样品在提取过程中，虽然被测组分得到了纯化，但因微量的组分分布在较大体积（数毫升）的提取溶剂中，提取液往往还不能直接进行分析。一些分析方法如ＧＣ法和ＨＰＬＣ法等都受到进样量的限制，若将提取液直接注入仪器，被测组分量可能达不到检测灵敏度，因此，常需要使组分浓集后再进行测定。第四章

（3）分离纯化与浓集第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理

③

被测组分浓集

浓集的方法主要有两种：一种方法是在末次提取时加入的提取液尽量少，使被测组分提取到小体积溶剂中，然后直接吸出适量供测定。另一种方法是挥去溶剂时应避免直接加热，防止被测组分破坏或挥失。挥去提取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干；对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物，可采用减压法挥去溶剂。第四章

（3）分离纯化与浓集第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理

④固相微萃取（solid-phasemicroextraction,SPME）

SPME装置简单，类似于气相色谱微量注射器。石英纤维表面涂有高分子固定液膜，对有机物具有吸附、富集作用。吸附-解析。第四章

（3）分离纯化与浓集第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理

⑤微透析技术（Microdialysis,MD）

实质上是一种膜分离技术，是一种利用膜透析原理，微量地对细胞进行流动性连续采样的新型采样和色谱样品制备技术。第四章

（3）分离纯化与浓集第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理

①使药物变成具有被分离的性质

②提高检测灵敏度

③增强药物的稳定性

④提高对光学异构体分离能力第四章目的

（4）化学衍生化第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理

①紫外衍生化反应

②荧光衍生化反应

③电化学衍生化反应

④手性衍生化法第四章方法

（4）化学衍生化第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理2尿液处理第四章适用：药物剂量回收、肾清除率和生物利用度测定、药物代谢研究第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理

尿中药物多数呈缀合状态,为测定尿液中药物总量,需将缀合物中药物释出.

①酸水解

②酶水解第四章

（２）缀合物的水解第四节生物样品分析方法的基本要求二生物样品的处理3毛发（头发）第四章适用：微量元素测定方法：有机破坏法湿法破坏干法破坏氧瓶燃烧法第四节生物样品分析方法的基本要求三定量分析方法验证第四章特异性标准曲线与线性范围精密度与准确度最低定量限样品稳定性提取回收率质控样品质量控制第四节生物样品分析方法的基本要求三定量分析方法验证第四章1，特异性排除干扰物质的能力

色谱法至少要提供空白样品色谱图，空白生物样品外加标准物质的色谱图，用药后的样品色谱图。第四节生物样品分析方法的基本要求三定量分析方法验证第四章2，标准曲线与线性范围γ≥0.9900

标准曲线至少5个浓度，线性范围要能够覆盖全部待测浓度，不包括零点。第四节生物样品分析方法的基本要求三定量分析方法验证第四章3，精密度与准确度

三个浓度（高、中、低）高浓度在标准曲线的上限附近，低浓度选择在最低定量限附近。每一个浓度测定5个样品。精密度：一般RSD应小于15%，在LOQ附近小于20%。准确度：相对回收率（加样），一般85%-115%，在LOQ附近80-120%。第四节生物样品分析方法的基本要求三定量分析方法验证第四章4，最低定量限

符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。

要求LOQ至少能满足测定3-5个半衰期时样品中的药物浓度或Cmax的1/10-1/20时的药物浓度。第四节生物样品分析方法的基本要求三定量分析方法验证第四章5，样品稳定性存放时间和条件第四节生物样品分析方法的基本要求三定量分析方法验证第四章6，提取回收率（绝对回收率）

高中低3个浓度，预处理过程的回收率，反映样品预处理过程中组分丢失的情况，是评价萃取方案优劣的指标之一。一般低于100%，70%，50%可用第四节生物样品分析方法的基本要求三定量分析方法验证第四章7，质控样品(QC)

系将已知量的待测物加入到生物介质中配置的样品，用于质量控制。第四节生物样品分析方法的基本要求三定量分析方法验证第四章8，质量控制

每个未知样品一般测定一次，必要时进行复测，每批生物样品测定时应建立新的标准曲线，并平行测定高中