改良多重实时荧光定量PCR检测流感A型和B型病毒

改良多重实时荧光定量PCR检测流感A型和B型病毒邸红芹;杨永辉;朱桂云;王晓玲;杨庆志;范海霞;王亮;张辉【摘要】ObjectiveTosetupamodifiedmultiplexreal-timefluorescencequantitativePCR(MRT-PCR)assaytodetectinfluenzavirusAandBrapidly.MethodsTheMRT-PCRassaywasestablishedaccordingtotargetsequenceofinfluenzavirusAandBspecificgeneselectedbybioinformaticsanalysisresults.Thestandardproductsandqualitycontrolsampleswerebuilttoevaluatethesensitivity,specificityandrepeatabilityofthesystem.ResultsTheMRT-PCRdetectionsystemwassuccessfullyestablishedbasedonTaqman-molecularbeacon(Taqman-MB)probeandHomo-TaqAssidtedNon-Dimer(HAND)system.Thedetectionlimitoftheassaywas102copies/μl,whichshowedgoodspecificityandrepeatability,withcoefficientofvariation(CV)being0.99%~2.50%.ConclusionAfast,specific,sensitive,stable,modifiedMRT-PCRdetectionsystemissuccessfullyestablished,whichpossessesfavourableapplicationprospectinclinicalpracticePCRBABMRT－PCRTaqman－分子灯标探针的PCR102copies／μl，特异性良好，重复性良好，变异系数（CV）0．99％～2．50％。结论建立了快PCR（MRT－PCR）检测体系，具有良好的临床应用前景。【期刊名称】《河北医药》【年(卷),期】2016(038)023【总页数】4页(P3529-3532)【关键词】多重实时荧光定量PCR;同源加尾系统,Taqman-分子灯标;流感病毒【作者】邸红芹;杨永辉;朱桂云;王晓玲;杨庆志;范海霞;王亮;张辉【作者单位】050041石家庄市，河北省胸科医院;050041石家庄市，河北省胸科医院;050041石家庄市，河北省胸科医院;河北省唐山市丰润区第二人民医院;河北省唐山市丰润区第二人民医院;河北省三河市中医医院;050041石家庄市，河北省胸科医院;050041石家庄市，河北省胸科医院【正文语种】中文R373流感病毒(influenzavirus，IFV)为分节段(8RNA(M)抗原决定簇的差异，分为三种不同型：ABCA(influenzavirusA，IFA)和B型流感病毒(influenzavirusB，IFB)是引起人感染的主要病毒，其可导致上呼吸道感染且能迅速传播流行，特别是在老人和儿童等人群中发病率和死亡率较高[1]。传统的检测方法，如鸡胚组织培养接种以及血清学诊断，由于其IFVIFVPCR技术(MRT-PCR)以其高通量、高灵敏性、高特异性及操作快速简便等优势，在IFV诊断中有很大的应用空间。多重PCR体系中存在多对引物和探针，在反应过程中容易造成引物探针交叉干扰，导致扩增效率降低，因此，本文基于同源加尾系统(homo-Taqassidtednon-dimer，HAND)建立改良的Taqmam-分子灯标(Taqman-MB)多重实时荧光定量PCR检测IFA和IFB，并优化和评价所建立的改良MRT-PCR体系。(influenzaA，IFA)、乙型流感病毒(influenzaB，IFB)、副流感病(Parainfluenza，PIV)、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)、冠状病毒和腺病毒(adenovirus，ADV)来源于疾控中心以及本院检验科分离培养，整个过程完成按照国家传染性病原体的安全操作规范进行。RNA(HighPureViralNucleicAcidKit，Roche)提取试剂盒1.5mlEP200μl10min；将混合液加入高纯过滤管中，8000g30s500μl于高纯过滤管中，8000g30s，弃离心后的液体；向高纯过滤管中加入450μl，8000g30s，135μl洗脱溶液，8000g2min-80℃保存备用。NCBIIFAIFBMEGA4.0PCRIFAIFBTrans10PCRPCR验证阳性样本重新接种于LB液体培养基中，37℃160r/min震荡培养过夜，1.5ml的菌液于EP管中，12000r/min离心30s，弃除上清液；加入250μlP1，并彻250μlP2EP6～8EP350μlP3，6～8000r/min10minCP3(吸附柱)中，12000r/min30sCP3600μlPW，12000r/min30s1CP31.5mlEP50μlEB，2min，12000r/min2minEP(Eppendorf)测定质粒浓度并根据公式计算其拷贝数，通过公式计算质粒原始拷贝数，拷贝数(copies/μl)=6.02×1023×质粒浓度(ng/μl)/(碱基数×660)，再用无核酸酶水(RNA-freeddH2O10(107～10copies/μl)，IFAIFBMRT-PCRIFAIFBBeacondesigner8.0MRT-PCRDNAFoldingAutoDimerprimer5NCBI5’Tag5’FAMHEX，3’DABCYL。各探针引物序列均送往上海生工生物合成。1。MRT-PCRRoche480PCRTaqmanFastVirusOne-stepMasterMix(InvitrogenMRT-PCR25μl)，TaqDNAdNTPRNase0.5μlTag引物(浓度40μmol/L)，多重PCR体系中引物(浓度40μmol/L)和探针(浓度20μmol/L)采用矩阵法按照0.25、0.20、0.15和0.10μl梯度优化，选择最佳的引物探针浓度。PCR反应程序为50℃，15min(逆转录反应)；95℃，10min(热启动)；95℃，15s(变性)，62℃，25s(退火)，72℃20s(延伸)，5个循环(富集)；95℃，15s(变性)，62℃，30s(退火，收集荧光)，72℃20s(延伸)，35个循环(扩增)。IFAIFB7(107～10copies/μl)，进行MRT-PCRMRT-PCR(parainfluenza，PIV)、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)、冠状病毒(coronaviruses)和腺病毒(adenovirus，ADV)等相关呼吸道病原体的核酸为模板，MRT-PCRIFAIFB1∶1107～102copies/μlMRT-PCR10SPSS13.0统计软件，计量资料以表示，采用tχ2P<0.052.1引物和探针浓度优化通过引物和探针的梯度MRT-PCR检测试验，得出该诊断体系中，IFA的检测引物和探针浓度分别为(FAM通道)0.20μl和0.15μl；IFB的检测引物和探针浓度分别为(HEX通道)0.15μl和0.15μl。因此，建立的MRT-PCR体系为25μl，包括：模板RNA5μl，TaqmanFastVirusOne-stepMasterMix(Invitrogen)13.5μl，Tag引物0.5μl，IFA的上下游检测引物各0.20μl0.15μl，IFAIFB0.15μl，RNA-freeddH2O5.0μl1。MRT-PCR107～10copies/μlIFAIFB的质粒混合模板，完成MRT-PCR检测，所建立的改良MRT-PCR检测体对IFA和IFB的最低检测浓度为102copies/μl，各反应之间的引物探针的交叉干扰较小，能够同时扩增不同的靶序列，能满足单一体系中检测两种流感病毒的要求。见图2。MRT-PCRHighPureViralNucleicAcidKit50A(influenzavirusA)阳性样本，50个流感B(influenzavirusA)样本，30virus)阳性样本，20(respiratorysyncytialvirus)阳性样本，10(coronaviruses10RT-PCR50AB2。MRT-PCR107～102copies/μl10MRT-PCRCt(s)和变异系数(CV)，以评价本方法的重复性和稳定性。CV0.51%～1.975%，表明MRT-PCR体系重复性良好。见表3。流感是由流感病毒引起的常见呼吸系统疾病，其具有高度的传染性，流行范围广泛，且临床表现又极为相似，给临床医师诊疗带来极大困难。李岩等[2]对河北省2009至2015年度流行性感冒进行病原学监测，显示：63397例流感样标本的阳性率为16.89%(10705例阳性)，其中IFAH1N1亚型4179例、季节性H3亚型3674例及IFB2595例，表明河北省流行高峰出现在当年11月至次年2月，以IFAH1N1亚型流感病毒流行为主，与IFB型流感病毒和季节性H3亚型病毒呈共同或先后交替感染流行的特点，儿童感染阳性率(5～15岁)最高。流感病毒快速、准确的诊断是临床治疗合理用药的关键，传统的检测方法如分离培养和血清学实验，耗时长且检测效率低。随着分子生物学的发展，多种新的诊断手段被用于各种呼吸道病毒的诊断，如实时荧光定量 PCR[3，4]、恒温扩增[5,6]以及基因芯片技术[7，8]等。周雪花[9]纳入了2009年9月至2013年12月收集的2489例本院就诊患者拭子标本，运用实时荧光定量PCR诊断其特异性的核酸序列，共检测出676例阳性标本(阳性率27.16%)，其中主要流行的病毒为IFA和IFB，该方法可用于快速检测流感病毒核酸，用于流感病毒流行病学调查。吕沁风等[10]基于环介导等温H1N1LAMP120H1N1H1N28[12NASBART-PCR2PCRPCRPCRPCRPCRPCRPCRTaqmam-MB探针(Taqman-灭基团尽可能的靠近，解决背景荧光高的问题，同时将探针臂也做为序列识别位点，使探针与靶序列结合更加紧密，提高杂交的效率[13，14]。此外，我们引入了同源加尾系统(HAND)解决扩增过程中引物二聚体的问题，其原理是：在PCR的初始阶段由于引物较高的溶解温度(Tm值)低浓度的加尾引物特异的与靶序列结合，扩增并富集两头带有Tag的PCR产物，若此时有引物二聚体形成，加尾引物两头的互补序列会构成一个稳定的发夹结构，致使其不能进行扩增，从而极大地减少了引物二聚体对荧光定量PCR的干扰[15-17]。兰全学等[18]基于同源加尾体系建立快速诊断中食源性致病菌的MRT-PCR体系，临床样本检测显示该方法特异且敏感性高，与金标准的结论一致。本文首先建立了改良的基于HAND系统的MRT-PCR体系，经一系列方法学验证，该检测体系灵敏度良好，检测最低限为1×102copies/μl，基本能满足流感病毒的检测要求；改良的MRT-PCR体系具有很高的特异性，能够特异的检测IFA和IFB，其他病毒检测无阳性结果；此外重复性检验得出该体系CV为0.51%～1.97%，均小于5%，重复性和稳定性良好，表明建立的改良MRT-PCR体系能够用于流感病毒的快速检测，为流感的有效防控提供高效、可靠及精确的技术方法。E-mail：【相关文献】vonItzsteinM.Thewaragainstinfluenza:discoveryanddevelopmentofsialidaseinhibitors.NatRevDrugDiscov,2007,6:967-974.李岩,韩光跃,刘艳芳,等．2009-2015TaqManMGBAB,2007,33:21-25．XiangL,ChenSJ,WangX,etal.Rapiddetectionoffourkindsofrespirovirusesbyreal-timefluorescencequantitativeRT-PCR.JTropMed,2014,14:461-465.MoriY,KandaH,NotomiT.Loop-mediatedisothermalamplification(LAMP):recentprogressinresearchanddevelopment.JInfectChemother,2013,19:404-411.罗思思，谢芝勋，谢亚基，等.H7N9RT-LAMP,2015,46:1176-1183.CannonGA,CarrMJ,YandleZ,etal.Alowdensityoligonucleotidemicroarrayforthedetectionofviralandatypicalbacterialrespiratorypathogens.JVirolMethods,2010,163:17-24.MillerMB,TangYW.Basicconceptsofmicroarraysandpotentialapplicationsinclinicalmicrobiology.ClinMicrobiolRev,2009,22:611-633.PCR2014，28:178-179．H1N1FAST-LAMP