分子生物学研究进展

分子生物学研究若干进展1、概况

2000年6月26号，美国总统和人类基因组的科学家宣布人类基因草图绘制完毕。一、人类基因组计划（HumanGenomeProject,HGP）这标志着人类探索生命奥秘的进程和生物科学技术的发展进入一个崭新的时期，同时也预示着一批以基因技术为核心的新兴产业的兴起。

2、人类基因组计划的发展历程

二十世纪50年代，发现了DNA的双螺旋结构，这是人类研究基因的一个突破点。从此拉开了对人类和其它生物的遗传物质载体的研究序幕，研究者逐步对决定生物遗传特性的密码进行破译，搞清基因的氨基酸排列顺序。1985年美国科学家诺贝尔奖获得者杜伯克首先提出了人类基因组计划，目的在于通过国际间的合作，识别人类DNA中所有的十万个以上的基因，测定人类DNA的30亿个碱基对顺序，以建立详细的人类基因组遗传图和物理图，解读关系人类生、老、病、死的遗传信息。美国政府于1990年正式启动该项计划，预计投资30亿美圆，先后共有美、英、日、法、德、中六国参加，分别负担了其中54%、33%、7%、2.8%、2.2%和1%的研究工作；1998年，全球最大的DNA自动测序仪厂家帕金埃尔默在美国马里兰州罗克威尔设立了Celera基因组学公司，声称在3年内完成人类基因组的序列测定，另外有一些私营机构也涉足这一领域，目的都是为了申请专利，垄断人类基因信息资源；正是“公”与“私”的竞争，使得人类基因组计划的日期一再提前，6月26日，人类基因组序列图谱草图终于公布。这一成果被誉为“达尔文以后意义最为重大的生物学发现”，预示着一个崭新的以基因技术为主的生物时代的到来，Celera基因研究公司基因组研究创始人克雷格、文格尔称“21世纪将是生物技术的时代，将是基因的时代”。

后基因组计划：定位全部基因，研究有用基因的功能，破译人类相关基因信息并开发和利用这些信息。以功能性、应用性研究为主的后基因组计划、功能蛋白质计划、重大疾病基因组计划等课题研究将相继进入实施阶段。

3、我国的基因组计划进展情况

1987年，我国的863计划就开始资助与基因组有关的研究项目。我国的人类基因组计划于94年正式启动，由国家自然科学基金委员会、863计划和国家重点基础研究计划所共同资助创建“中华民族基因组若干位点基因结构的研究”项目。先后在上海和北京成立了国家人类基因组南、北两个中心，投入巨额资金进行基因组研究。1999年9月，我国搭上基因组研究的末班车，加入该计划并负责3号染色体上3000万个碱基对的测序工作，成为参与人类基因组计划唯一的发展中国家。这1%的测序任务，带给中国的利益是长远的，我们不仅因此可以分享整个计划的成果，拥有相关事务的发言权，而且建立了自己的研究队伍，技术水平走在了世界的前列。

我国在积极参与人类基因组计划的同时，还注意发掘保护我国丰富的物种基因资源，自主开展进行了数个研究项目。近年来，我国在疾病相关基因和生物功能基因的研究领域取得了一系列的进展。目前我国已经启动“中国生物资源基因组计划”，前期将开展水稻、猪和血吸虫基因的研究。这些研究的完成将给我国的农业、器官移植、疾病防治等方面带来巨大的进步。今年年初，我国科学家破译了一种噬热菌的遗传密码，获得了国内第一个微生物“工作框架图”。我国首株辛德毕斯病毒(XJ－160病毒株)全基因组序列测定，也已经由中国预防医学科学院病毒学研究所研究人员完成，并已录入国际基因库。

3、基因研究给我们带来什么？

人类基因组计划极大的推动了生命科学和生物技术的基础性研究，将有利于促进生命科学技术与材料科学等其它高新技术的结合，带动相关产业的发展。人类基因组计划完成后，破译的大量基因信息将成为医学、医药以及农业等方面技术创新的源泉，其研究成果产业化带来的商业利润是无法估量的，同时也会给我们的生活带来翻天覆地的变化。

（1）医学革命

人类基因组计划的重要作用首先体现在与人类生命息息相关的医学领域，它的伟大意义不仅仅是引导医学的一次重大革命，将人类感知生命的里程提高到分子水平阶段，更为重要的是它将给人类的生存能力和生命、生活质量带来突飞猛进的提高。主要体现在以下几个方面：①提高生命质量

不远的将来人类将能活到一百五十岁。因为利用基因技术人类可以详细解读自身的生命信息，提高生存、生活质量。科学家可以根据每个人特定的基因图谱判断这个人的健康情况，预测某种疾病潜在的发病可能性，向病人提供有效的警告或提示，这样就可以采取措施预防疾病的发生。将出现基因身份证所有的基因状况及相关遗传信息优良基因及其在基因图中位置基因缺陷和某些“不良”基因以及“不良”“有害”基因在基因图中的位置，并指出将与何种疾病相联系何时会患病基因治疗和基因修补的顺序和安排饮食要求和生存环境的最佳要求婚配要求---适宜于与某种人结婚和不宜于与某种人结婚②了解疾病基因长寿基因（8000多种疾病）肥胖基因侏儒基因脑残基因厄舍氏综合症基因躁狂抑郁症基因（自杀基因）记忆基因糖尿病基因肿瘤和癌基因冒险基因长寿基因③基因诊断

对人类基因全面研究完成后，疾病的基因诊断技术将进入开创性的时代。基因诊断技术，作为一种快速、高效、准确的诊断方法，在人类基因密码被解读后将会迅速成长起来。基因诊断的优势不仅仅是快速、高效、准确，而且具有两个无可比拟的优势：1）超前性：利用基因诊断可以在某些遗传疾病或病毒性疾病在发病前就诊断出来，这使得许多疾病的提前预防成为可能，这种超前性的诊断还可以让医生根据每个人的特点制定治疗方案；2）即时性：在治疗过程中可以利用基因治疗对患者的病情进行快速检验，有助于医生根据实际情况对治疗方案进行及时的修改。目前在美国每年要进行多达400万次的基因临床检验，许多大医院对新生儿做镰刀状细胞贫血、先天性甲状腺病以及苯丙酮尿症的常规检查，以提前发现新生儿是否存在遗传性疾病隐患。提到基因诊断技术，不能不提到基因芯片。只要把病人的一滴血放在芯片检测卡上，与检测器相连的电脑就会将相应的基因变化信息显示出来，对疾病进行准确诊断。下面介绍芯片技术（一）基因分析芯片开发的动力

遗传信息迅猛增长：随着人类基因组（测序）计划（Humangenomeproject）的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而,怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。

相关学科与技术的高度发展和相互渗透：当代与信息产业相伴随的计算机、精密机械等科学技术是大规模解析基因信息的基础，而基因芯片从实验室走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且借助激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。科学的发展人类的进步要求进行大规模基因信息的解析

鉴于基因芯片的多种用途和其远大的发展前景，不少生命科学研究机构和生物技术公司都先后参与了这项技术的研究。据不完全统计目前仅国内就有十多家单位从事该技术的研究与开发工作，全世界估计至少有二三十家。它已象半导体技术一样成为一个重要的产业方向。当前已正被广泛地应用于诸多领域，包括生物医学、临床诊断学和基因组学研究。（二）基因分析芯片的简要描述

1.什么是基因芯片

基因芯片指对数以千记的DNA片段同时进行处理分析的技术，诸如基因组DNA突变谱和mRNA表达谱的检测等（TrendsinBiotechnology)。

该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片技术的主要特点

技术操作简单自动化程高序列数量大检测效率高应用范围广成本相对低3基因芯片的主要类型

鉴于信号的获取与解读具有通用性，所以此处不予特别介绍。（1）从点阵的制备方法来分主要有两类：原位合成型与“点膜”型。原位合成型：指根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子。聚合之后芯片片基的制作即告结束。该方法有两类：光引导原位聚合技术与压电打印原位聚合技术。

光引导原位聚合技术的简要过程：首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来，选取适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其它部们不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护，进而与单体分子共价结合。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。优点：合成效率高，点阵密度高缺点：设备昂贵，技术复杂，反应产率低

压电打印原位聚合技术其装置与普通的彩色喷墨打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。即，将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为40到50个碱基的探针。优点：设备廉价，技术相对简单，反应产率高缺点：点阵密度低，易产生交叉污染“点膜”型合成工作用传统的DNA固相合成仪完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷，以便能够牢固地结合寡核苷酸分子。该方法是目前大多数中小型公司所采用的方法。优点：设备廉价，技术简便，研制周期短，灵活性高缺点：点阵密度低（2）从支持物来分主要有：薄膜型：如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。这种类型“芯片”的点阵是通过“点膜”形式制作的，并通过一定的方法使探针能够牢固地结合于其上，整个过程类似于斑点杂交技术（如CloneTech公司）。玻片型：这种芯片的点阵是通过原位合成技术制作的，点阵密度很高，所以必须借助于特殊的仪器对测定结果进行解读和分析。当前具有此类产品研制能力的公司很少（如Affimetrix公司）。

微板型这种芯片实质上是一种具有高密度、小容量测试孔的小型酶联免疫检测板（如PE公司等）。

集成电路型将杂交技术与微电子技术结合于一体有目的地通过电子装置检测或控制DNA等生物大分子的作用过程（如Nanogen公司）4.基因芯片研制的总体蓝图

研制方向的确定基因组序列分析与待检基因探针序列的确定检测样品的制备探针阵列的准备检测设备的研制杂交检测与数据分析（三）基因芯片的主要应用1基因表达检测拟南芥、酵母基因表达研究等2突变检测BRCAⅠ基因外显子11]、CFTR基因、β-地中海贫血、酵母突变菌株、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等3基因组多态性分析人类基因组单核苷酸多态性的鉴定及分型，人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等

4基因文库作图通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图5杂交测序6Etc.生物芯片

生物芯片是八十年代末在生命科学领域迅速崛起的一项高新技术，通过微加工技术和微电子技术在固格体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。基因芯片(Genechip，DNAchip,DNAmicroarray)即为生物芯片的一类，常用生物芯片还有蛋白质芯片(Proteinchip)和芯片试验室(Lab-on-a-chip)两种。生物芯片是涉及计算机、微电子、化学等多学科的交叉技术，具有高通量、微型化和自动化等特点，主要应用于基因表达测序、疾病诊断、药物筛选、基因突变及多态性分析等领域。生物芯片的发展一方面依赖于人类基因图谱的破解，另一方面也促进了该计划的实施。

基因生物芯片的研究是生物技术进入后基因时代后的主要任务之一，它的出现被称为是继大规模集成电路后的又一重大突破。美国于1998年6月正式启动生物芯片计划，我国在1998年也开始此项研究，许多项目由国家自然科学基金提供资助。世界范围内许多大公司也相继参与生物芯片的研究开发，美国已经有多家从事生物芯片生产的公司上市，表现出良好的成长性。

据有关报道，自2000年6月起，国家计划生育委员会采用陕西超群公司生产的基因芯片，对育龄人群和胎儿进行乙肝、丙肝和爱滋病病毒的快速诊断。

④基因治疗

基因治疗就是利用基因工程的手段，通过向人体导入功能基因，修补、改变相应的缺陷基因，以对相关疾病进行治疗和预防。对基因治疗的临床研究早在十年前就开始了，90年美国研究人员对一个4岁的小女孩施行了基因治疗，使她的病情大大好转。十年来，基因治疗技术在实验过程中取得了不少的成果，载体的改进和靶的细胞的选择使基因治疗技术的效果也不断提高。

法国巴内克医院成功地用基因疗法治愈了两个患先天性重度免疫缺陷症（SCID）的儿童。SCID是因患者X染色体上的基因缺陷引起的，这种基因缺陷使免疫系统无法正常发育，导致患者体内缺少抗感染的T淋巴细胞和巨噬细胞。

传统的骨髓移植疗法因缺少适合的骨髓成功率较低，现在的基因疗法取出患者自身骨髓中的血液干细胞，利用含有缺损基因的逆转录RNA病毒感染这些血液干细胞，使原先发生异常的基因恢复正常。经反复感染后恢复正常的干细胞被植入患者体内，繁殖并逐步取代发生基因缺陷的细胞，从而使患者具备正常的免疫功能。现在两个患儿正处于恢复时期并继续进行治疗。虽然各方面对基因疗法仍然存在异议，法国研究人员的这一成果无疑极大的鼓舞了国际医学界，向世界证明用基因疗法治疗某些疾病的可行性。目前基因治疗的发展水平虽然还未达到临床应用的阶段，但是就相关领域基础研究的发展速度和该技术的蓬勃发展势头来看，再过几十年后基因治疗完全有望成为一种普遍的治疗手段。我国已经有胃癌、肝癌、恶性脑肿瘤和血友病B、闭塞性脉管炎等疾病的基因治疗方案进入或年内进入临床实验，首批基因治疗产品10年内有望投入市场。现在全世界进入临床试验阶段的基因治疗方案有396个，其中三分之二的病例是针对癌症等恶性肿瘤疾病。中国医学科学院院长巴德年教授预测，再过20年人类就有望攻克癌症，基因治疗技术无疑将在疑难病症的治疗领域发挥巨大不可替代的作用。

PCR技术（2）发现许多有趣的事实猴子是怎样变成人的？揭开“蓝血人”的奥秘。犹太人和阿拉伯人是兄弟日本人来自中国欧洲人祖先可能是7位女性。现代人起源争论看基因，找亲戚谁最聪明？（3）基因工程药物开发

人类基因组计划对医药领域的最大利好就是将促进基因工程药物的研究开发。人类基因组研究将会为新药的研制和筛选提供必要的信息和行之有效的手段，科学家届时可以根据癌症、心脏病等疾病的病因，有针对性的开发选择治疗药物。广大的患者将是基因技术促进药物发展的最大获益者，基因技术使药物对疾病的疗效、针对性不断提高，而价格却不断降低，特别是基因技术为一些疑难，甚至在以前称为绝症的疾病提供了治疗途径。同时利用基因技术开发药物给广大企业带来了巨大的商机和利益。早在80年代，一些具有战略眼光的企业就已经涉足基因工程制药领域，其中最为常见的是一些治疗性蛋白如基因重组激酶、基因工程疫苗、细胞因子、干扰素等产品。基因药物内含的经济价值巨大，据有关报道，芬兰一家生物技术公司将促红细胞生成素基因植入牛体内，这样一头转基因牛所产的乳中具有的基因价值高达42亿美元。我国在去年也成功培育出转基因羊，其分泌的乳汁中含有凝血第九因子，能对血友病患者进行治疗。

二、蛋白质组计划：解析蛋白质的功能蛋白质芯片：一个蛋白质组学研究的高通量解决办法原理：利用蛋白间的相互作用，如抗体抗原相互作用，或配基和受体相互作用，甚至药物和蛋白相互作用来检测能和待测样品相互作用的蛋白。应用：诊断疾病：如传染病、肿瘤、遗传病及心血管疾病等蛋白质相互作用研究蛋白质与DNA相互作用研究药物筛选全力挑战蛋白质组学，生命科学进入后基因时代。三、转基因技术的发展与应用-为生命科学的研究与发展提供了一个前景广阔的应用平台动物转基因促进生长刺激肌肉发育促进产毛生产药物

荷兰某公司用转基因牛生产一种乳铁蛋白，以这种牛的奶制成的奶粉具有抗菌、转铁等功效，其一年的销售额达到50亿美元抗病育种组织器官移植动物生物反应器植物转基因技术

农业属于基础产业，是关系到国计民生的重要产业，因此受到基因研究的特别关注。新一轮生物技术浪潮的核心是农业生物技术，龙头是医药生物技术，两翼分别是海洋生物技术和环境生物技术，后继则包括轻工等领域。去年5月，我国正式启动超级杂交水稻基因组计划，计划在一年内测定水稻基因组的4.3亿个碱基对。相关基因组计划的实施和产业化应用，将给传统的农业带来一场绿色革命。

根据水稻基因图谱，我们可以加快基因育种的速度，可以有选择的培育出具有高产、抗旱涝、抗虫等优良特性的农作物。植物转基因技术应用有：抗病抗虫改良品质利用杂交优势增产抗逆抗除草剂

改变花卉及观赏植物基因工程安全性几个事件普斯陶伊事件斑蝶事件“终结者”事件标签风波偷窃事件史密斯报告四、克隆技术

克隆即为无性繁殖。证明已经高度分化的体细胞可以回到生命的起点，从头开始。1、转基因动物与克隆技术-多利2、波利3、多特抗目4、转基因药物工厂5、中国的转基因山羊6、泰国克隆牛“英”克隆技术带给人类的种种好处显而易见。克隆技术将导致器官移植的重大突破，人们不会再为移植器官来源不足烦恼，也不用对因异体移植带来的排异问题而忧虑，克隆技术为器官移植患者带来更大的生存希望。现在英国的研究者正将克隆技术用于人造血液的制造，他们以人类血浆取代带有人类基因的牛和羊体内的血浆，然后对这些动物进行克隆或繁殖，从而获得便宜可靠的“血液生产工厂”。利用克隆技术还可以大量复制获得“药物生产工厂”、“蛋白质生产工厂”，可以复制濒临灭绝的珍稀动物。基因克隆也对相关疾病的研究、药物的开发具有重要的作用。人类基因组计划的实施将促进克隆技术的良性发展，为基因克隆技术提供基础的、方向性的指导。

7、克隆人？克隆人的身份再不需要男性成为恐怖分子的工具大量基因结构相同的克隆人，诱发新疾病的广泛传播心理缺陷五、干细胞技术干细胞是一种具有复制能力、可以分化成各种功能细胞的早期未分化细胞。干细胞领域的两大技术突破：

体外培养和增殖人体胚胎干细胞：因为胚胎干细胞可以在一定条件下分化形成各种组织，所以可能被用来取代病人体内的坏损组织细胞，达到治疗疾病的目的。但是，它受到至少两个方面的限制：一是胚胎干细胞的来源，包括由于胚胎来源带来的伦理和法律问题；二是由于作为一种异体细胞移植而带来的免疫排斥问题。

干细胞具有“横向分化”的功能：一旦这种“横向分化”分子机制被研究清楚，就可以利用病人自身的健康组织干细胞，诱导分化病损组织的功能细胞，从而治疗各种组织坏损性疾病。这样既克服了由于异体细胞移植的免疫排斥，又可以避免胚胎细胞来源不足以及其受人关注的社会伦理和法律问题，从而为治疗多种疾病，如癌症、心肌坏死性疾病、自身免疫疾病和神经退行性疾病等创造了一种革命性治疗手段。同时，将干细胞生物工程和基因治疗相结合，还可以治疗遗传性疾病。

干细胞及其衍生物组织器官的临床应用，是人类在21世纪的最大科技成果之一，必将产生一种全新的治疗技术，是对传统医疗手段和医疗观念的一场革命。即人类从此能够利用干细胞技术，再造正常的甚至更年轻的组织器官。这种再造组织器官的新医疗技术，将使任何人都能用上自己（或他人）的干细胞和干细胞衍生的新组织器官，来替代病变或衰老的组织器官，并可以广泛涉及用传统医学方法难以医治的多种顽症。

世界首例成人神经干细胞自体移植成功干细胞帮助瘫痪小鼠行走。瑞典医学家已经利用干细胞生物工程成功地治愈了帕金森病维持染色体稳定，防止染色体末端序列降解或丢失，阻止不同染色体末端融合使染色体附着在核膜上端粒六、端粒、端粒酶和肿瘤端粒：

DNA－蛋白质复合物DNA：5~8bp线性重复排列人：5‘-TTAGGG-3’

总长5~15kb蛋白质：核被膜蛋白、TRF1、TRF2等末端复制问题1984年

Shampay等人

四膜虫端粒序列导入酵母菌后被延长延长部分：酵母菌端粒序列1985年

Greider等人四膜虫细胞提取液中存在酶活力，可延长端粒

RNaseA处理后失活端粒酶：核糖核蛋白（蛋白质－RNA）

蛋白质：逆转录酶（TERT）、Hsp90、p23、

TLP-1、TEP1RNA：模板（TR）端粒长度维持(a)端粒酶机制(b)重组机制端粒理论1973Olonvikov

端粒DNA逐渐丢失，触发细胞退出细胞周期，即死亡1990Harley

端粒长度可能是细胞有丝分裂年龄标识，导致衰老1992Allsopp

证明端粒参与细胞衰老1995Rhyu

提出较完整的理论端粒随细胞分裂不断变短，分裂一定次数后，端粒缩短至一临界长度（Hayflicklimit），一些细胞周期相关蛋白检测到后，启动端粒信号传导系统，通过p14ARF/p53/pRb途径，使细胞退出细胞周期进入M1期（mortalitystage1）；在各种内外因影响下，端粒信号传导系统失灵而使细胞逃逸M1期而继续分裂，端粒进一步缩短，进入M2期（mortalitystage2）；绝大多数细胞死亡，极少数细胞端粒酶被激活，细胞永生/恶变端粒酶不是一个癌基因端粒酶的存在使得细胞可以分裂但不引起分裂表达端粒酶可以延长细胞寿命、延长或维持端粒长度，但不引起恶性转化的表型诱导分化因子可以使端粒酶活性下降分裂刺激因子可以使端粒酶活性上升端粒酶的激活在转录水平（c-Myc）、转录后加工（变异剪接）及翻译后修饰（丝/苏氨酸激酶磷酸化）等方面受到调控端粒长度检测：端粒限制性片段分析（TRF）：

HinfI消化DNA，SouthernBlot端粒酶检测：组份检测：RT－PCR（hTR，hTERT）活性检测：TRAP

组份≠活性TelomericRepeatAmplificationProtocol(TRAP)

TS:5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’CX:5’-(CCCTTA)3CCCTAA-3’

端粒序列(TTAGGG)nTeloTAGGGTelomerasePCRELISA(RocheDiagnostics)诊断方面