《辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程》编制说明

《辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程》编制说明一、工作简介（一）任务来源辽宁绒山羊原产于我省辽东南山区，有其适应当地环境的生理特点；绒山羊胚胎移植技术还没有省级标准，尤其是操作技术方面是空白，国家行业标准NY/T826—2004《绵羊胚胎移植技术规程》和NY/T1571—2007《羊胚胎移植技术规程》偏向技术理论，可操作性不强；随着生物科学技术发展胚胎移植所用试剂耗材等也有很多进步。因此，亟待有一套绒山羊胚胎移植技术操作规程来规范当下该技术在辽宁绒山羊的操作与应用。2017年3月，为了促进绒山羊选育工作和胚胎移植技术推广应用，畜牧业标准化技术委员会（辽宁）提出了制订《辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程》项目申请，我院负责规程起草制订。2017年6月，省质量技术监督局下达了地方标准制修订计划《辽宁省质量技术监督局关于下达2017年第一批辽宁省地方标准制修订项目计划的通知》，计划编号2017292。（二）协作单位标准编制单位为辽宁省畜牧科学研究院。（三）主要工作过程1.成立了标准起草组织机构提出规程编制任务后，按照《地方标准管理办法》要求，我们成立了由院领导和技术骨干人员组成规程制定项目小组。领导组负责规程制定的方案审定和组织协调；项目小组负责制定实施方案和起草规程等工作，项目组成员集体学习了标准制定相关知识，保证了规程制定工作的顺利实施。2.查阅了相关技术资料，确定了规程框架与主要内容；开展重复试验，撰写规程初稿项目组收集查阅了相关技术资料，包括NY/T1571-2007《羊胚胎移植技术规程》、NY/T826-2004《绵羊胚胎移植技术规程》、NY/T1674-2008《牛羊胚胎质量检测技术规程》等，将这些标准中重要指标做为重要参考，梳理出了规程框架结构和主要内容。2017年5月、6月和9月开展了三批次试验，结合2001年以来10多次试验，重复验证重要指标、主要内容和操作过程。10月项目组根据试验和操作撰写了规程初稿，内容完全按照操作流程展开，文字尽量详细描述，附录了计划表、记录表、胚胎图片等，使规程完全展现操作过程，为相关科技人员提供参考、参照。3.征求意见后修改完成标准送审稿2018年5月～6月，标准主要起草单位辽宁省畜牧科学研究院就《辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程（初稿）》，通过辽宁省畜牧兽医局官方网站()向国内各省区广泛征求科研、教学、养殖生产等方面有关人员意见。提出意见份共条，我们全部或部分采纳意见条，其余不予采纳，并根据采纳意见，标准起草工作组对《辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程》的内容进行修正和补充；2018年月日形成了完整的《辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程》标准送审稿。2018年月日，辽宁省质量技术监督局组织专家对《辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程》标准送审稿进行了审定，专家组一致同意通过审定，并提出具体修改意见。根据会审专家审定意见，标准起草工作组对标准进一步修改，2018年月日形成《辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程》（报批稿），上报辽宁省质量技术监督局，报请辽宁省质量技术监督局作为推荐性行业标准，尽快颁布实施。（四）主要起草人标准主要起草人：豆兴堂、朱延旭、宋先忱、张兴会、郭丹、李丰田、杨文凯、王家明、全治国、丁世伟。二、标准编制原则和确定地方标准主要内容（一）编制原则本着科学性、规范性、实用性相结合的原则，参考国内法规、标准和有关文献资料，结合辽宁绒山羊实际，科学地确定标准体系框架与主要内容，并对其内容进行准确、详细、规范性描述。编写格式符合GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求。（二）主要内容本标准内容主要包括范围、规范性引用文件、术语和定义、羊只选择与管理、超数排卵与同期发情、胚胎移植、术后观察7部分。1.范围本规程规定了辽宁绒山羊胚胎移植技术的操作规范。本规程适用于辽宁绒山羊品种的胚胎生产及移植技术操作。2.规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4630辽宁绒山羊NY/T826-2004绵羊胚胎移植技术规程NY/T1571-2007羊胚胎移植技术规程NY/T1674-2008牛羊胚胎质量检测技术规程NY/T2893-2016绒山羊饲养管理技术规范3.术语和定义本条款对术语，辽宁绒山羊、巴氏玻璃管进行了定义。条款内容为：3.1辽宁绒山羊Liaoningcashmeregoat原产于辽宁省辽东半岛山区，体表长绒毛的山羊。3.2巴氏玻璃管Pasteurizedglasstube是一种两端开口的玻璃管，通常内径约5毫米，管的一端拉细，内径较小。4.羊只选择与管理本条款介绍供受体母羊、种公羊选择与饲养管理要点。条款内容为：4.1羊只选择时间与数量比例胚胎移植前15d～30d，选择供体羊、受体羊以及种公羊。供体羊与受体羊的数量比例为1︰5～6。4.2供体羊、受体羊选择与管理供体羊为年龄2～5周岁的经产母羊，且符合辽宁绒山羊GB/T4630一级以上标准，系谱清楚准确，健康无病，膘情适中，产羔后4个月以上，连续观察到2个以上正常发情周期。供体超排处理前15d内不做免疫，单独组群饲养。受体羊为年龄2～5周岁的经产母山羊，健康无病，膘情适中。产羔3个月以上，连续观察到2个以上正常发情周期。同期发情处理前15d内不做免疫，单独组群饲养。供体羊与受体羊处理前15d～30d，除按照NY/T2893—2016标准饲养管理要求投喂饲料外，额外补饲胡萝卜0.5Kg/天·只，避免应激。4.3种公羊选择与管理与配种公羊年龄2～6周岁，符合辽宁绒山羊GB/T4630特级以上标准，系谱清楚准确。健康无病，膘情适中，性欲旺盛，上一年度有繁殖记录。种公羊配种前15d～30d，除按照NY/T2893—2016标准饲养管理要求投喂饲料外，需额外补饲胡萝卜1Kg/天·只，鸡蛋3枚～5枚，适当运动，配种前1周～2周开始排精，3次～5次/周。4.4试情公羊选择与管理年龄2～5周岁，性欲旺盛，健康无病，膘情适中。按照NY/T2893—2016标准饲养管理。与供体羊、受体羊试情时，试情公羊要佩戴试情布或试情板，防止误配。5.超数排卵与同期发情本条款介绍了供体羊超数排卵与供受体母羊同期发情技术操作，本条款内容为：5.1试剂耗材供体羊超数排卵与同期发情试剂耗材：促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)或促黄体素释放激素A3（LHRH-A3）、孕马血清促性腺激素(PMSG)、氯前列烯醇(PG)、维生素A+D+E注射液等；羊用孕酮栓（CIDR）及放置枪、75%酒精棉球、0.9%生理盐水、5mL注射器。受体羊同期发情试剂耗材：PMSG、PG、LHRH-A3、维生素A+D+E注射液等；羊用CIDR及放置枪、75%酒精棉球、0.9%生理盐水、5mL注射器。5.2供体羊处理胚胎移植一般宜在9月至11月进行。根据超数排卵及同期发情技术操作推荐程序（附录A），放栓时每只羊肌肉注射维生素A+D+E2mL～3mL。利用放置枪将CIDR栓呈水平状态放入羊只生殖道内，操作过程中严格消毒。放置CIDR栓当天计为0天。第11d开始每只羊肌肉注射FSH1mL（15～20mg）/次，共8次，肌肉注射PG0.7mL～1mL。撤栓后12h开始公羊试情，间隔6h～8h；供体羊接受试情公羊爬跨时，判定为发情，种公羊及时配种，首次配种后供体羊静脉注射LH50IU～100IU或肌肉注射促黄体素释放激素A320～25ug,每天配种3～4次，直至供体羊不接受爬跨为止。记录供体羊发情时间及配种时间。5.3受体羊处理与供体羊同步实施同期发情。放栓时肌肉注射维生素A+D+E2mL～3mL/只。按照同期发情技术程序肌肉注射PMSG200IU～250IU/只，撤栓。同期发情技术操作推荐程序见附录A。6.胚胎移植本条款介绍了胚胎移植的准备、供体羊胚胎冲取、拣胚与鉴定分级、胚胎移植，本条款内容为：6.1准备工作6.1.1胚胎操作液胚胎操作液用于胚胎冲取、拣胚、鉴定和移植等，一般选用磷酸盐缓冲液（PBS）。PBS液可使用市售成品或自行配制，主要成份与配制方法见附录B。6.1.2手术器械准备可升降式羊用手术车、可移动式手术器械车、无影灯、水浴锅。手术盘，手术刀柄与刀片，直头及弯头止血钳，直头及弯头手术剪，持针钳，固定钳，剃须刀片，镊子，中号圆针，中号棱针等器械，将上述器械用蒸馏水清洗干净，牛皮纸包装后，120℃、30min条件下高压灭菌后待用；术前在0.1%新洁尔灭液中浸泡30min，使用前用灭菌的0.9%生理盐水冲洗。6.1.3药品与耗材准备甲硝唑注射液、青链霉素、碘酊（棉球）、75%酒精（棉球）、矿物油、兽用麻醉药846合剂、兽用苏醒药盐酸苯恶唑、结晶磺胺、新洁尔灭、0.9%生理盐水；乳胶手套、手术服、口罩、鞋套、手术无菌洞巾、中号丝线、敷料、喷壶、注射器（50mL、10mL、5mL、1mL）。6.1.4胚胎操作设备与耗材立体显微镜、腹腔镜、水浴锅、控温加热台、集卵杯、35mm培养皿、10#冲胚管、巴氏玻璃管、16#套管针、7#输液器皮针、细玻-塑料管、记号笔、0.22um滤器、微量移液枪(1mL、200uL)、枪头（1mL、200uL）、酒精灯、75%酒精、95%酒精、面巾纸、铝饭盒、白钢盘等。巴氏玻璃管等玻璃器具用清水洗净后，依次采用浓硫酸中浸泡24h、流水冲洗30min、洗涤剂刷洗、流水冲洗1h、蒸馏水冲洗5次、超纯水冲洗5次后，放置于干燥箱中烘干，用牛皮纸包装，120℃、30min条件下高压灭菌待用；铝饭盒、白钢盘等依次采用流水、蒸馏水冲洗，枪头（1mL、200uL）装盒，用牛皮纸包装，120℃、30min条件下高压灭菌待用。6.2供体羊胚胎冲取6.2.1场所要求待术羊圈应靠近准备室。准备室是用于手术羊只保定、剃毛、消毒等术前处理的场所。手术室紧挨准备室，胚胎操作室以窗口与手术室相通，用于胚胎捡取、鉴定分级及装移植管等胚胎操作。手术室与胚胎操作室术前紫外线照射消毒1h～2h，室温保持在20℃～25℃。各室间需采取物理措施隔离，术前用0.2%新洁尔灭消毒液对地面喷洒擦拭消毒。6.2.2胚胎冲取时间供体羊于计划周期的第17d，对2～8细胞期胚胎手术冲取；早期囊胚于第21d冲取。6.2.3手术准备术前羊只禁食不少于24h，可少量饮水。将羊只仰面保定于手术架上，头下尾上，固定四肢；在乳房延向腹部长约20cm宽约15cm为术区，用弯头手术剪剪除术区绒毛，剃须刀片将短毛剃净，清洗术区皮肤、晾干。每只羊按0.01ml/kg体重肌肉注射兽用麻醉药846合剂，待羊只头部自然下垂时，用固定钳将无菌洞巾四角与皮肤固定，用碘酊（棉球）对皮肤消毒，2min～3min后75%酒精（棉球）对涂碘酊区皮肤脱碘。注射麻醉药后，注意羊只状况，防止口腔异物窒息。手术前用0.1%溶液浸泡3min～5min洗手消毒，再用灭菌生理盐水冲洗。6.2.4手术冲胚输卵管冲胚在距乳房约5cm的腹中线一侧，避开血管，用手术刀纵向切开皮肤长约8cm～10cm，用手术柄将皮下脂肪及腹肌分离，直至腹膜，零星出血处用敷料压迫止血，若有血管破裂出血用直头或弯头止血钳止血，敷料清创。轻轻将腹膜做一切口，用剪刀将腹膜剪开长约5cm～8cm左右切口；术员手部消毒后，食指及中指伸入腹腔，将子宫角拉出至创口外，适当牵拉卵巢，观察排卵情况，做好记录。将细玻-塑料管的玻璃管端从左侧输卵管伞口送入约3cm左右，捏紧伞口与套管并固定，针另一端准备用集卵杯收集冲胚的操作液。用7#输液器皮针在宫管结合部往输卵管伞方向30度刺入3cm左右，确定针位于输卵管腔内，注射器取10mL～20mL胚胎操作液，再与输液器皮针相连，匀速持续推注操作液，观察液体回收情况，如遇阻力时可调整皮针或玻璃管位置；冲胚完成后皮针刺入点若出血需用敷料按压止血，卵巢及输卵管表面点滴少许矿物油后，送入腹腔。右侧胚胎冲取同上。两侧冲取完毕后，腹腔内注入甲硝唑液，关闭创口。创口沿腹部至乳房方向，用中号圆针、丝线连续缝合腹膜肌肉层，避免伤及腹腔内器官；创口撒放适量结晶磺胺粉，用大号棱针、丝线结节缝合皮肤层，缝线间距1cm左右；皮肤缝合完毕后，向其表面喷洒适量碘酊液或碘酊（棉球）消毒，3min～5min后用75%酒精（棉球）脱碘；肌肉注射兽用苏醒药（盐酸苯恶唑）0.02mL～0.04mL/kg体重。术后羊只肌肉注射青霉素（160万IU）及链霉素（100万IU），每天2次，连续施药3d～7d。胚胎回收及移植记录表见附件C。子宫角冲胚切口操作同输卵管冲胚。将左侧子宫角拉出创口，调整角度位置牵拉卵巢，观察排卵情况，做好记录。用消毒回型针头在左右子宫角分叉处扎一口，将10#冲胚管往输卵管方向送入约3cm～5cm，向球囊内注入2mL～4mL空气，确认充盈的球囊与子宫角腔完全紧实密封，冲胚管另一端与集卵杯相连准备接收冲胚操作液。在宫管结合部避开血管扎一口，将16#套管针套管从口往子宫方向送入约3cm～5cm，确认针位于子宫角腔内，捏紧子宫角与套管并固定。注射器取50mL胚胎操作液，与套管另一端相连，匀速持续推注操作液，观察液体回收情况，如遇阻力时可调整针的位置，冲胚完成若有出血需先敷料按压止血后，用35℃生理盐水清洗，卵巢子与宫角表面滴矿物油，送入腹腔。右侧胚胎冲取同上。其他缝合等操作同上。胚胎回收及移植记录表见附件C。6.3拣胚与鉴定分级6.3.1准备打开热台电源开关，设置温度38.5℃。拣胚管可购买市售成品，也可自制。自制捡胚管时，在火焰上拉伸巴氏玻璃管，距管肩部2cm～5cm左右火焰烘烤，使之形成30度角；断针，断口内径200um～300um，并做钝化处理。在3个～5个35mm培养皿内分别加入2mL胚胎操作液，做好编号标记。6.3.2拣胚集卵杯静置3min～5min，立体显微镜20×倍率下，根据胚胎的形态、大小、折光性辨别寻找胚胎，注意集卵杯边缘处胚胎的存在，在拣胚管中先吸入一小段胚胎操作液，再拣取胚胎，放入含胚胎操作液的35mm皿内，一般拣取2遍。捡取完后将胚胎在胚胎操作液中洗涤3遍，操作中要避免胚胎丢失。洗涤后进行胚胎质量检查，确定胚胎级别，做好记录。胚胎回收及移植记录表见附录C。6.3.3鉴定分级立体显微镜20×～40×倍率下仔细观察，根据胚胎的大小、形态、色调，卵裂球大小、数量、均匀度，液泡，游离细胞等影响胚胎发育的因素，结合获取时的胚胎阶段，综合鉴定与分级。依据NY/T826—2004、NY/T1571—2007和NT/T1674—2008标准进行胚胎鉴定与分级。各发育期胚胎图例见附录D。6.4胚胎移植6.4.1时间2～8细胞期胚胎第17d手术移植于第15d发情受体羊只。早期囊胚第21d移植于第15d发情受体羊只。术前羊只禁食12h～24h，少量饮水。胚胎与受体母羊匹配关系见附录E。6.4.2器械、药品与耗材器械、药品与耗材和供体羊手术相同。另需黄体酮。移胚管可购买市售成品，也可自制。自制移胚管时，可将拉制的巴氏玻璃管（见自制捡胚管）另一端与乳胶管相连，乳胶管另一端与1mL注射器相连，注意连接处要密闭。6.4.3移植胚胎装移植管先吸0.2mL空气，吸入约0.1mL胚胎操作液，再吸入约0.05mL～0.1mL空气，然后吸入含2～3枚胚胎的操作液0.1mL，吸入约0.05mL～0.1mL空气，再吸入约0.1mL胚胎操作液，待用。胚胎装管方法见图1。图1胚胎装移植管方法示意图手术移植方法.1输卵管移植手术准备、打开腹腔、缝合等操作同供体羊胚胎冲取手术。提拉子宫角观察卵巢黄体情况，正常黄体为卵巢表面火山口状红色突起，一般将胚胎移植到黄体侧，无黄体不移植；根据受体羊发情时间与胚胎发育阶段分级情况确定移植胚胎，一般移植2枚～3枚，胚胎装移植管。暴露卵巢和输卵管伞，在伞与卵巢系膜附近寻找输卵管口，将装入胚胎的移胚针送入约2cm～3cm，匀力慢速推动注射器，将胚胎送入输卵管，并观察输卵管充盈状态，未充盈则移植失败，可重新移植。肌肉注射黄体酮15mg～25mg，记录黄体、胚胎情况。见附录C。.2子宫角移植.2.1开腹手术法手术准备、打开腹腔、缝合等操作同供体羊胚胎冲取手术。确定卵巢黄体、移植胚胎、胚胎装移植管等操作同上。钝型针在子宫角避开血管扎一口，将装入胚胎的移植针送入约2cm～3cm，确认针位于子宫角腔内，匀力慢速推动注射器，将胚胎送入子宫角。肌肉注射黄体酮15mg～25mg，记录黄体、胚胎情况。见附录C。.2.2腹腔镜微创法手术准备、缝合等操作同供体羊胚胎冲取手术。距乳房3cm～5cm，腹中线两侧3cm～5cm，避开血管用手术刀各做1cm～2cm切口，穿刺套管针从切口穿透肌肉、腹膜直达腹腔，取出穿刺针；另一切口用穿刺针刺入，操作同上，穿刺时要避免伤及腹内脏器，取出穿刺针，从切口送入弯头止血钳，备用。打开腹腔镜，将窥视镜从套管送入腹腔，止血钳配合寻找卵巢并观察黄体情况，确定卵巢黄体、移植胚胎、胚胎装移植管等操作同输卵管移植。用止血钳将子宫角牵拉至切口外，钝型针在子宫角避开血管扎一口，将装入胚胎的移植针送入约2cm～3cm，确认针位于子宫角腔内，匀力慢速推动注射器，将胚胎送入子宫角。肌肉注射黄体酮15mg～25mg，记录黄体、胚胎情况。见附录C。7.术后观察手术完成后，解除羊只四肢固定物，轻缓运至待术羊圈，苏醒后可站立行走，若出现复眠情况，可驱赶促其苏醒。密切观察术后羊只状态，异常状况对症处理。三、主要试验（或验证）的分析报告、相关技术和经济影响论证、预期的社会经济效益按照本规程开展辽宁绒山羊优秀种羊胚胎移植扩繁，每只供体羊预期可获得4～8只良种后代，公母比例按照1︰1计算，可获得2～4只良种种公羊和2～4只良种母羊，种公羊通过人工授精技术可改良上万只低产绒山羊，优秀母羊做母本可继续实施胚胎移植扩繁良种羊，如此循环进行，大量增加了良种群体，缩短了绒山羊育种世代间隔，提高了育种进程；有效稳固了我省绒山羊种羊大省地位，同时，改良后代产绒量增加，促使养羊户逐渐淘汰低产羊，缓解环境压力，提高了养羊经济效益，引导市场供给优良绒山羊，提高了绒山羊产业供给侧结构改革成效。综上所述，本