碱性磷酸酶km值测定

碱性磷酸酶km值测定实验目的学习环境因素对酶促反应速度的影响；学习米氏方程及Km值得测定；测量碱性磷酸酶km值；实验原理

E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等（一）米－曼氏方程式中间产物

酶促反应模式——中间产物学说E+Sk1k2k3ESE+P相关E学原理※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式(Michaelisequation)。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]Km+[S]＝──米－曼氏方程式推导基于两个假设：(1)E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即V＝k3[ES]。(2)

S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。

推导过程稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即[ES]恒定。K1([Et]－[ES])[S]＝K2[ES]+K3[ES]K2+K3＝Km（米氏常数）K1令：则(2)变为:([Et]－[ES])[S]＝Km[ES](2)＝([Et]－[ES])[S]K2+K3[ES]K1整理得：当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即[Et]＝[ES]，反应达最大速度Vmax＝K3[ES]＝K3[Et](5)[ES]＝───[Et][S]Km+[S](3)整理得:将(5)代入(4)得米氏方程式：Vmax[S]Km+[S]V＝────将(3)代入(1)得K3[Et][S]Km+[S](4)V＝────当反应速度为最大反应速度一半时

Km值的推导Km＝[S]∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2（二）Km与Vmax的意义

Km值①Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。②意义：a)Km是酶的特征性常数之一；b)Km可近似表示酶对底物的亲和力；c)同一酶对于不同底物有不同的Km值。

Vmax定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。意义：Vmax=K3[E]如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数(turnovernumber)，即动力学常数K3。定义—当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。意义—可用来比较每单位酶的催化能力。

酶的转换数（三）Ｋm值与Ｖmax值的测定双倒数作图法(doublereciprocalplot)

-1/Km1/Vmax1/[S]1/VVmax[S]Km+[S]V=林-贝氏(Lineweaver-Burk)方程+1/V=KmVmax1/Vmax1/[S]两边同取倒数

Hanes作图法[S][S]/V-KmKm/Vm在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S][S]/V=Km/Vmax+[S]/Vmax酶浓度对反应速度的影响当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V=K3[E]0V[E]当[S]>>[E]时，Vmax=k3[E]酶浓度对反应速度的影响双重影响温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低。温度对反应速度的影响最适温度(optimumtemperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。*低温的应用酶活性0.51.02.01.50102030405060温度ºC温度对淀粉酶活性的影响pH对反应速度的影响最适pH(optimumpH)：酶催化活性最大时的环境pH。0酶活性pH

pH对某些酶活性的影响

胃蛋白酶

淀粉酶

胆碱酯酶

246810碱性磷酸酶km值的测定以不同浓度的磷酸苯二钠作为碱性磷酸酶的底物，在最适条件下(pH=10.0，37℃)，准确反应15min。在碱性条件下产物酚可以与酚试剂作用生成蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm波长比色，色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：然后，以吸光度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以吸光度的倒数作纵坐标以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。1．酚试剂2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液3．碱性缓冲液(pH-10.0)4．碱性磷酸酶液【试剂】

称取磷酸苯二钠635mg，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，加氯仿数滴以防腐，置于冰箱中可保存1年之久。

称取无水Na2CO36.36g和NaHcO33.36g，先以适量蒸馏水溶解，再定容至1000ml。称取碱性磷酸酶lmg，加水3~4ml，置于冰箱可保存5周左右。操作试剂（ml）1234562.5mM磷酸苯二钠0.20.40.60.81.01.0蒸馏水0.80.60.40.2－－碱性缓冲液1.01.01.01.01.01.0混匀后，37℃水浴5min碱性磷酸酶0.10.10.10.10.1－混匀后，37℃水浴15min(准确计时）酚试剂1.01.01.01.01.01.0碱性磷酸酶－－－－－0.110%碳酸钠3.03.03.03.03.03.0混匀后，37℃水浴15min,以第6管调0与650nm比色，读取各管A值。实验数据及结果管号