分子生物学原核生物转录

分子生物学原核生物转录教学要求掌握一些基本概念:转录的不对称性,,反义链,转录单元掌握大肠杆菌RNA聚合酶的组成及各部分的功能理解大肠杆菌σ因子尤其是σ70的功能和识别序列掌握原核生物转录的过程第1节转录的基本原则第2节大肠杆菌RNA聚合酶第3节大肠杆菌σ70

启动子第4节转录过程主要内容MolecularBiologyCourse第1节

转录的基本原则一、转录概述二、RNA合成的过程1.转录(Transcription):生物体以DNA为模板合成RNA的过程。

TranscriptionRNADNA

一、转录概述CentralDogmaofmolecularbiologyInformationstoreinDNAflows:FromDNA→DNA(Replication)FromDNA→RNA(Transcription)FromRNA→Protein(Translation)FourtypesofRNAmadeMessenger

RNAMostoftheRNAincellsisfoundinribosomes--ourprotein-synthesizingmachinesThetransferRNAmoleculesusedtoaddeachnewaminoacidtogrowingproteins.SmallRNAmoleculesareinvolvedinregulating,processinganddisposingoftheconstanttrafficofmessengerRNA.MessengerRNATransferRNARibosomalRNASmallNuclearRNA(eukaryotes)2.转录所需的物质Theprecursorribonucleotides(前体核糖核酸):NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)Template(模板):DNAEnzyme(酶):RNApolymerase(RNA-pol)RNA聚合酶OtherproteinfactorsRNAistranscribed5→33.转录所需的模板(1)结构基因：DNA分子上，能编码RNA或蛋白质的DNA片段。(2)Templatestrand(antisense

strandorWatsonstrand)模板链或反义链:

根据碱基互补原则指导RNA合成的DNA链。

(3)Codingstrand(sense

strandorCrickstrand)编码链或有义链:与mRNA序列相同的那条DNA链nonsensesenseRNApolymeraseATPGTPCTPUTP5335TemplatestrandCodingstrandCodingstrandTemplatestrandStructuralgeneDirectionoftranscriptionDirectionoftranscription4.Asymmetrictranscription(不对称转录)

DNA链上只有部分的区段作为转录模板(反义链或模板链),且模板链并非自始至终位于同一股DNA单链上，称为转录的不对称性。5.transcriptionunit（转录单元）一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。包括上游调控区、结构基因区、下游转录终止区三个部分。原核生物的转录单位多为多顺反子,真核生物中的转录单位多为单顺反子。转录起点即转录原点记为＋1，其上游记为负值，下游记为正值。PromoterTerminatorTranscribedregionSensestrandAntisensestrandDNARNATranscription+1StructureofatypicaltranscriptionunitIstranscribedregionequaltocodingregion?Why?单林娜制作15

lacIRegulatorygenelacZlacYlacADNAm-RNAβ

-GalactosidasePermeaseTransacetylaseProteinStructuralGenesPlacIPlacOlac6.转录与复制的比较相同点的：Template:DNA底物:nucleotideDirection:5′→3′DNA-dependentpolymerase依赖DNA的聚合酶Watson-CrickbasepairingProduct:polynucleotidechain多聚核苷酸链不同点replicationtranscription模板两股链均作为模板模板链作为模板原料dNTPNTP聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶产物子代DNA双链mRNA;tRNA;rRNA配对A-T；G-CA-U；T-A；G-C引物需RNA引物--------方式(特点)半保留复制不对称转录二、

RNA合成的过程RNA聚合酶识别启动子Initiation起始Elongation延伸Termination终止第2节大肠杆菌RNA聚合酶以DNA为模板合成单链RNAArthurKornberg(left)withhisson,Roger,afterRogerreceivedtheNobelPrizeinChemistryfor2006.ArthurKornbergreceivedtheNobelPrizeinPhysiologyorMedicinein1959.BothfatherandsonarefacultymembersattheStanfordUniversitySchoolofMedicine.Kornbergswiththepolymerases"Therehavegottobetensofthousandsofpeoplearoundtheworldtodaywhoseeyesaretearingupwiththenewsthathe'sgone.""Hewasanextraordinaryscientist.Hisaccomplishmentsmightbecalledlegendary."

不需要引物以DNA为模板5′3′合成需要Mg2+没有3’5’外切活性，核苷酸的错误掺入率为10-4-10-5

由多亚基构成的酶一、RNApolymerase以DNA为模板，催化2个游离的NTP形成3’，5’-磷酸二酯键二、E.coliRNA聚合酶E.coli

只有一种RNA聚合酶，指导所有类型RNA的合成最大的酶之一全酶至少由5个亚基构成,2alpha(a),and1ofbeta(b),betaprime(b’),omega(w)andsigma(s)亚基RNA合成的速率:37oC下

40nt/sE.ColiRNApol的亚基组成β’βα

α

ω

σ

只用于起始

用于起始和延伸

BacterialRNApolymerase1.α亚基由rpoA编码核心酶的组建因子

促使RNApol与DNA模板链结合前端α因子－－使模板DNA双链解链为单链尾端α因子－－使解链的单链DNA重新聚合为双链α＋α2α＋β

α2β＋β’BacterialRNApolymeraseb

由rpoB

编码,b’由rpoC

编码.RNA聚合酶的催化中心.bsubunit：含有两个结构域分别负责转录的起始和延伸。2.bandb亚基b’亚基结合两个锌离子，参与酶的催化功能。负责酶与模板DNA相结合(充当SSB的作用)。许多原核生物含有多个s

因子，用于识别不同的启动子，最常见的是s70核心酶与s因子结合转变为全酶。启动子识别中起着关键的作用转录起始后，sfactor解离(RNAchainis9-10nt)细胞中s

因子比其他亚基少。3.s

因子E.coli中不同的因子可识别不同的启动子GeneFactorUseSequenceSeparationSequence－35

－1070

General32HeatshockEHeatshock

54

Nitrogen

Fflagellar

大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析亚基基因相对分子量亚基数组分功能αrpoA365002核心酶核心酶组装，启动子识别βrpoB1510001核心酶β和β'共同形成RNA合成的活性中心β'rpoC1550001核心酶用于模板的结合ω？110001核心酶？σrpoD700001σ因子存在多种σ因子，用于识别不同的启动子CoreEnzyme

具有的四个功能位点

ααβ’β★DNA/RNA杂交位点(β)

★D.S.DNA解链位点(α)

★D.S.DNA重旋(α)

★启动子识别位点

σ★DNA无义链结合位点(β’)

4.全酶（HoloEnzyme）功能用于转录的起始和延伸依靠空间结构与DNA模板结合(σ与核心酶结合后引起的构象变化)专一性地与DNA序列(启动子)结合结合常数：1014／mol转录效率低，速度缓慢（σ的结合）BacterialRNApolymerase5.核心酶（CoreEnzyme）的功能作用于转录的延伸过程（终止）依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之间）非专一性的结合（与DNA的序列无关）结合常数：1011／molBacterialRNApolymeraseT3RNA聚合酶和T7RNA聚合酶小分子转录速度快(200nt/sec)

识别自身启动子RNApolymerasediffersfromorganismtoorganism6.其他RNA聚合酶第三节大肠杆菌s70启动子一、Promoter启动子二、promoterefficiency启动子的效率一、Promoter启动子特异的短的保守序列位于转录起始位点的上游，用负数表示。是RNA聚合酶特异性结合和转录起始所必须的。是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。Differentpromotersresultindifferingefficienciesoftranscriptioninitiation,whichinturnregulatetranscription.PromoterTerminatorTranscribedregionSensestrandAntisensestrandDNARNATranscription+1-55to+20:全酶的结合-20to+20:聚合酶紧密结合，防止DNaseΙ的降解Uptoposition–40:最重要

(mutagenesisanalysis)-10and–35sequence:6bp,对大肠杆菌基因的起始转录最关键s70promoter开始转录TTGACAAACTGT-35区(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10区1-30-5010-10-40-205335原核生物启动子保守序列RNA-pol辨认位点(recognitionsite)55RNA聚合酶保护区结构基因33-10sequence(Pribonowbox，Pribonow框)高度保守序列，位于DNA解旋开始的部位。由6个碱基组成，其中心位于-10位置处，在许多不同的大肠杆菌基因启动子中都存在。保守序列为TATAAT.头两个碱基(TA)和最后的碱基T高度保守。与转录起始位点(+1)之间的距离为5-8bp。其功能是:(1)RNApol紧密结合;(2)形成开放启动复合体；酶在此处与DNA结合成稳定的复合物，在转录方向上解开双链形成开放型起始结构。

(3)使RNApol定向转录。-35sequence(Sextama盒,Sextamabox):RNA聚合酶的起始识别区；σ亚基识别-35序列，为转录选择模板位于-35位置处的一个保守的六聚体序列TTGACA头三个碱基(TTG)是高度保守的与–10box之间的距离为16-19bpRNA聚合酶的松弛（初始）结合位点RNA聚合酶依靠其σ亚基识别该位点，为转录选择模板——识别位点重要性:很大程度上决定了启动子的强度Transcriptionstartsite转录起始位点转录开始时模板上的第一个碱基，90％基因的起始位点是嘌呤G比A普遍(i.e.CGTorCAT)在起始核苷酸的两侧是C和T大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区T85T83G81A61C69A52T89A89T50A65A100二、promoterefficiency启动子的效率Thereisconsiderablevariationinsequencebetweendifferentpromoters,andthetranscriptionefficiencycanvarybyupto1000-fold.The–35sequence:s因子识别的区域.The-10sequence对DNA解旋起着重要的作用。起始位点周围的序列影响起始效率。最初转录的30个碱基控制着RNA聚合酶离开启动子，使另一聚合酶复合物重新起始转录的速率。Somepromotersequencearenotsufficientlysimilartotheconsensussequencetobestronglytranscribedundernormalcondition,thusactivatingfactorisrequiredforefficientinitiation.Example:LacpromoterPlacrequiresactivatingprotein,cAMPreceptorprotein(CRP，环腺苷酸受体蛋白),tobindtoasiteontheDNAclosetothepromotersequenceinordertoenhancepolymerasebindingandtranscriptioninitiation.Weakpromotersandactivatingfactor第4节转录过程一、RNA链起始二、RNA链延伸三、RNA链终止一、RNA链起始Promoterbinding启动子结合DNAunwindingDNA解旋RNAchaininitiationRNA链起始1.启动子的结合寻找启动子的速度非常快全酶与－35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物and–10regionLink核心酶a2bb’w,

与DNA的结合无特异的亲和性，结合非常松散显著的增强全酶与正确启动子结合位点相结合的特异性。Theroleofsfactorinpromoterbinding

2.

DNA解旋全酶紧密地结合在-10序列处，模板DNA局部变性，形成开放的启动子二元复合体+1DNA解旋是必须的，使反义链通过碱基配对合成RNA。Negativesupercoilingenhancesthetranscriptionofmanygenes，sinceitfacilitates(有利于)unwinding.Somepromotersarenot.Exceptionalexample:promtersfortheenzymesubunitsofDNAgyrase(旋转酶)areinhibitedbynegativesupercoiling,servingasanelegantfeedbackloopforDNAgyraseexpression.Negativesupercoiling(负超螺旋)&unwinding3.

RNAchain起始+1酶移动到转录起始位点，第一个rNTP转录开始,σ因子释放,形成酶-启动子-rNTP三元复合体（ternarycomplex）。StartswithaGTPorATPRNApolymeraseholoenzyme(+sfactor)closedpromotercomplex(moderatelystable)thesigmasubunitbindstothe-10regiononceinitiationtakesplace,RNApolymerasedoesnotneedveryhighaffinityforthepromotersigmafactordissociatesfromthecorepolymeraseafterafewelongationreactionselongationtakesplacewiththecoreRNApolymeraseopenpromotercomplex(highlystable)theholoenzymehasveryhighaffinityforpromoterregionsbecauseofsigmafactorssigmacanre-bindothercoreenzymesThesigmacycless起始过程：RNA聚合酶全酶搜索并结合DNA特异位点RNA聚合酶全酶接触DNA分子,通过接触-解离-再接触搜索启动子序列闭和的启动子复合体RNA聚合酶（全酶）中的σ因子在DNA双链上迅速、随机滑动，寻找到启动子-35区，形成疏松的复合物，DNA双链未解开。开放的启动子复合体RNA聚合酶（全酶）移向-10区和转录起始点,在-20区DNA双链解开12-17bp时的启动子复合体。DNA-酶-底物NTP三元起始复合物的形成在聚合酶全酶的作用下，聚合第一个磷酸二酯键以及连续的一小段新生RNA链。当RNA聚合酶聚合新生RNA链为9~10个核苷酸时，σ因子脱离全酶，进入延伸阶段。σα2ββ’5’5’原核生物转录起始过程二、

RNAchain延伸Transcriptionbubble(转录泡)1)亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿3’5’方向前移；

2)在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。

3)RNA-DNA形成12bp长的杂交螺旋

4)转录产物RNA沿5’3’方向延长单林娜制作61

7启动子清除:起始成功后，s

因子释放出来，形成一个由RNA聚合酶-DNA-新生的RNA组成的三聚体，核心酶向下游移动离开启动子。Transcriptionbubble:(转录泡)17个核苷酸的DNA形成解链区，产物RNA链大约有12个核苷酸与模板形成RNA-DNA杂合双链RNA聚合酶沿着DNA链移动，在转录泡之间解开双螺旋，在转录泡之后形成双螺旋。TheE.colipolymerasemovesatanaveragerateof~40ntpersec,dependingonthelocalDNAsequence.Transcriptionbubble三、转录的终止

TranscriptionterminationofProkaryoticRNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。(一)、终止子的种类(二)、原核生物转录的终止TranscriptionterminationofProkaryotic

(一)、终止子的种类1、不依赖ρ因子的终止子/内在终止子(rho-independentterminators/intrinsicterminators)

体外实验中，只有核心酶和终止子就足以使转录终止。2、依赖ρ因子的终止子

(rho-dependentterminators)

蛋白质辅助因子－－ρ因子存在时，核心酶终止转录

两者有共同的结构特征（序列差异）1、不依赖ρ因子的终止子(强终止子)结构特征:☻一是形成一个发夹结构茎….7~20bp的IR(invertedrepetition)

序列形成（富含G/C）环….中间不重复序列形成发夹结构的突变可阻止转录的终止☻二是6~8个连续的U串(发夹结构末端)TranscriptionterminationofProkaryotic

“Hairpin”，发夹结构Weakassoc