一种新型带有卵磷脂基团可生物降解聚氨酯合成

一种新型带有卵磷脂基团可生物降解聚氨酯合成Abstract(摘要)Anovelpolyurethanewassuccessfullysynthesizedbychain-extensionofbiodegradablepoly(L-lactide)functionalizedphosphatidylcholine(PC)withhexamethylenediisocyanate(HDI)aschainextender(PUR-PC).Themolecularweights,glasstransitiontemperature(Tg)increasedsignificantlyafterthechain-extension.ThehydrophilicityofPUR-PCwasbetterthantheonewithoutPC,accordingtoawaterabsorptiontest.Moreover,thenumberofadhesiveplateletsandanamorphicplateletsonPUR-PCfilmwerebothlessthanthoseonPURfilm.Thesepreliminaryresultssuggestthatthisnovelpolyurethanemightbeabetterscaffoldthantraditionalbiodegradablepolyurethanesfortissueengineeringduetoitsbetterbloodcompatibility.Besides,thisstudyalsoprovidesanewmethodtopreparePC-modifiedbiodegradablepolyurethanes.摘要：一种新型的聚氨酯可以通过用可生物降解的聚（l-乳酸）与作为扩链剂的带有六亚甲基二异氰酸酯官能团的卵磷脂的扩链反应而合成。它的分子量和玻璃化温度（Tg）在扩链反应后会显著增加。根据吸水性试验测试，PUR-PC的吸水性比没有添加PC的PUR要好。此外，在PUR-PC薄膜上黏着的和变形的血小板数都比PUR薄膜上的少。这些初步结果表明：这种新型的有较好的血液相容性的聚氨酯在组织工程上的支撑作用比传统的能生物降解的聚氨酯要好。此外，这个研究也提供了一种新方法制备PC-改性的可生物降解的聚氨酯。Keywords（关键词）polyurethanesphosphatidylcholinebiodegradablebloodcompatibilitypolymersurface聚氨酯卵磷脂

生物降解血液相容性聚合物表面1.IntroductionBiomaterialsfortissueregenerationneedtobebiocompatibleaswellasbiodegradableinvivo.Polyurethanes(PURs)arewidelyusedinbiomedicalfieldsduetotheirexcellentmechanicalproperties[1].Inordertofurtherimprovetheirbloodcompatibility,lotsofmodificationmethodshavebeendeveloped.Amongthem,theimitationofcellmembranebyintroducingPCintoPURsisaveryeffectiveway[2‐5].组织再生生物材料必须具有生物相容性以及在体内的生物降解性。聚氨酯（PURs）由于其优异的力学性能被广泛应用于生物医学领域中[1]。为了进一步提高它们的血液相容性，已经做过了很多改性方法。其中，运用仿真细胞膜将PC引入到PURs中是一种非常有效的方法[2-5]。Forexample,arylazidesconsistingofaphotoactivatable4‐azidobenzoylgroupandaPCendgrouphavebeensynthesizedandthenthePC‐containingarylazideswerecoupledtopoly(etherurethane)surfaces.Manystudiespurporttoassessbloodcompatibilitybycountingadherentplateletsandchangingthemorphologyoftheplateletsonthesurfacesofmaterials.Whatismore,assoonasthebloodcontactsamaterial,theproteinstartstoadsorbontothematerialssurfaceandchangetheirconformation.Thus,theplateletsinteractwiththeseandeventuallystartingadheringandspreadingontotheproteinlayer.Theplateletsinthestateareactivatedtoreleasebloodcoagulationfactors[6].例如：一个photoactivatable4-azidobenzoyl基团和一个PC终止基团反应最终合成芳基叠氮化物而后把含PC的芳基叠氮化物涂抹在聚氨酯表面。许多研究指出，用贴壁血小板的数量和血小板在材料表面形貌改变的方法来评估血液相容性。更重要的是，血液一旦接触材料蛋白质就会很快的吸附在材料表面并改变其构象。因此，血小板与它们相互作用并最终开始吸附和蔓延到蛋白质层中。在内的被激活的血小板释放凝血因子[6]。So,thebloodcompatibilityofthemodifiedPURswasevaluatedwithathrombingenerationassayandaplateletadhesionstudy.ThemaximumthrombinconcentrationwaslowerthanthatoftheoriginalPURs.Meanwhile,theclottingtimeofthebloodwasalsoextendedandplateletadhesionwaseffectivelyreducedonthemodifiedPURs[4,5].However,allthemembrane‐likePURsreportedsofarareseldomlikelytodegrade,whichbecomesthemainlimitationfortheirfurtherapplicationintissueengineering.因此，在改性后的PURs的血液相容性可以用凝血酶生成试验和血小板粘附研究来评价。其最大凝血酶浓度比原始PURs低。同时，改性PURs的血液凝血时间延长，血小板粘附数减少[4,5]。但是，目前所有PURs膜样的报告很少可能会降低，这成为其在组织工程中进一步推广应用的主要限制因数。AlthoughbiodegradablePURswithoutPChavebeenintensivelyinvestigatedinrecentyears,suchaspoly(lactide)(PLA),poly(glycolicacid)(PGA),poly(caprolactone)(PCL)andtheircopolymersetc.[7‐11],theyarenotsobloodcompatiblecomparedtoPC‐containingPURs.近年来，虽然不含PC的可生物降解的PURs已深入调查，如聚（乳酸）（PCL），聚（羟基乙酸）（PGA），聚（己内酯）（PCL）及其它共聚物等[7-11]，他们与含有PC的PURs相比，没有那样的血液相容性。Inthisstudy,PUR-PC,anovelpolyurethanewithPCgroupsinthebiodegradablesoftsegments(PC-S)wassynthesized.Meanwhile,polyurethane(PUR),asacontrast,wassynthesizedinthesamewayusingPLLAassoftsegment(S).ThemolecularstructureandmolecularweightwereanalyzedbyprotonNMR(1H-NMR),Fouriertransforminfraredspectroscopy(FT-IR)andSizeexclusionchromatograph(SEC),respectively.Differentialscanningcalorimetry(DSC)wasusedtomonitorthethermalproperties.Thehydrophilicityandinvitrobloodcompatibilitywereevaluatedbywaterabsorptiontestandplateletadhesiontestrespectively.在这项研究中，PUR-PC，一种以PC基团作为生物降解软段的新型聚氨酯被合成。与此同时，PUR是用PLLA作为软段的合成方法合成。分子结构和分子量可以分别用质子核磁共振（H-NMR），傅立叶变换红外光谱（FT-IR）和尺寸排阻色谱（SEC）分析。差示扫描量热法（DSC）用来测定热性能。亲水性和体外血液相容性可以用吸水率试验和血小板粘附试验分别评价。2.Experiment（试验）

ThesynthesisofPC-Swascarriedoutundervacuumat120°Cfor36hbyusingglycerophosphatidylcholineasinitiator(Figure1)[12].ThenPC-Swasdriedfortwohoursundervacuumbeforeintroducingitintoathree-neckflaskwithtoluene,amagneticstirbarandstannousoctoate(catalyst).Theprescribedamountofhexamethylenediisocyanate(HDI)intoluenewasaddedintotheflaskdropwise(molarratioofHDI/prepolymer=3).PC-S在引发剂SnOct2的作用下，温控在120℃，真空反应36h后合成，然后把PC-S在真空中干燥两个小时后,再将加入到装有甲苯，磁搅拌棒和辛酸亚锡（催化剂）的三颈烧瓶中，甲苯中的六亚甲基二异氰酸酯（HDI）按规定量滴加入烧瓶中（摩尔比：HDI/预聚物=3）。ThereactionprogressedunderaN2atmosphereat120°Cfor7h.Theproductswereprecipitatedinethanolanddriedundervacuumtoaconstantweight.SynthesisofPURwithoutPCwascarriedoutinasimilarway.Figure1illustratesthesynthesisofPC-SandPUR-PC.Polymerswerecharacterizedby1H‐NMR(BrukerAVII‐400MHz),FT‐IR(Nicolet560).该反应在120℃的氮气中反应7h。产品在乙醇中沉淀并在真空干燥至恒重。合成不含PC的聚氨酯的方法与此类似。图1说明了PC-S和PUR-PC合成。可以用仪器1H-NMR(BrukerAVII-400MHz),FT-IR(Nicolet560)进行聚合物的表征。

SECwasperformedonequipmentcomposedofaWaters510HPLCpump,aWaters410differentialrefractometerandaPLgel5mmmixed‐C60cmcolumn,themobilephasebeingtetrahydrofuran(THF)andtheflowrate1mL/min.Thenumber‐average(Mn)andweight‐average(Mw)molecularweightswereexpressedwithrespecttopolystyrenestandardsobtainedfromPolysciences.DSC(NetzschDSC204)wasusedtocharacterizetheglasstransitiontemperature(Tg).SEC进行的高效液相色谱法的组成设备包括:一个510HPLC水泵,一个Waters410差示折光仪和一个PLgel5mm混合-C60cm色谱柱,流动相为四氢呋喃（THF）其流速为1mL/min。数均分子量（Mn）和重均分子量（Mw）就是以从Polysciences中得到的聚苯乙烯的值为标准。DSC(NetzschDSC204)被用来表征玻璃化转变温度（Tg）。Waterabsorptionwasusedtoevaluatethehydrophilicity.Itisdefinedastheweightpercentageofwaterinwetpolymerfilms.Thefilmswerepreparedbycasting1wt%polymersolution(inchloroform)ontopolyethyleneglycolterephthalate(PET)substrates(1cm×1cm).Aftervacuumdryingfor2days,thefilmswereweighed(W0)andplacedindistilledwater.Theywererecoveredatdifferenttimeintervals,carefullywipedwithfilterpaperandweighed(W1)again.吸水率被用来评价聚合物的亲水性。它被定义为湿聚合物薄膜中水重量的百分比。该薄膜是用质量分数为1％的聚合物溶液（氯仿）浇注在聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的基板（1cm×1cm）上的方法制备的。经过2天的真空干燥，薄膜称重（W0）和再放入到蒸馏水中。Thewaterabsorptionwascalculatedwiththefollowingequation:Wateruptake(%)=(W1−W0)/W0×100%Thebloodplateletadhesionevaluationwascarriedoutaccordingtothemethodreportedbyreference[2].Filmsweresputter-coatedwithgoldinvacuumandobservedbyusingascanningelectronmicroscope(SEM,JSM-5900LV,JeolLtd.,Japan).它们在不同的时间间隔恢复，仔细擦拭滤纸再次称重（W1）。水吸收率计算公式如下：吸收率=(W1—W0)/W0×100%评估血小板粘附性是按参考文献[2]报道的方法进行。薄膜真空喷射镀金，并用扫描电子显微镜(SEM,JSM-5900LV,JeolLtd.,Japan)观察。

3.ExperimentalResultsandDiscussion（实验结果与讨论）

3.1.TheStructureandCharacterizationofthePOLYMERs（

该聚合物的结构与表征）

ToobtainPC‐modifiedpolyurethane,bothsurfacemodificationandbulkmodificationmethodsaredevelopedbyresearchers.Inthebulkmodification,PCisnormallyintroducedbyagraftreactionafterchainextension.Inaddition,PCcouldalsobeintroducedduringthechain‐extendingreaction.Inthissituation,PC‐containingchemicalsservedaschain‐extenders[3].研究人员通过表面改性和单体改性两种方法获得PC改性聚氨酯。在单体改性的方法中，PC通常在扩链后由接枝反应植入。此外，PC也能够在扩链反应时被引入，在这种情况下：含有PC的化学品作为扩链剂Inthisstudy,abiodegradablepolyurethanewithPC(PUR‐PC)wassynthesizedaccordingtothesyntheticroutedemonstratedinFigure1.Thesynthesisstrategyissimilartothatofthenormalpolyurethane,whichincludesthesynthesisofsoftsegmentsinitiallyandthenthechain‐extension.PLLAwithPC(PLLA/PC)tooktheroleofthesoftsegment,thepartofpolylactide(PLA)iswidelyrecognizedtobebiodegradableinphysiologicalenvironment.。在这项研究中，含PC（PUR-PC）的可生物降解的聚氨酯按照如图1所示的合成路线合成。这种合成路线类似于正常的聚氨酯，其中包括最初的软段合成和之后的扩链。含PC的PLLA（PLLA/PC）起软段的作用，一部分聚乳酸在生理环境中的生物降解性是被公认的。PLLA/PCwaspreparedbyring-openingpolymerizationoflactidewithglycerophosphorylcholineasinitiator(seeFigure1).ThemolecularstructureswereconfirmedbytheresultsofFT-IR,13C-NMRand1H-NMRanalysiswhichwereconsistentwiththosereportedbefore[12](datanotshown).Chainextensionwasthencarriedoutaftertheconfirmation.HDIservedasthechain-extender(seeFigure1).FT-IRand1H-NMRwerealsoemployedtoanalyzethemolecularstructureoftheobtainedpolyurethane.PLLA/PC可以在SnOct2的催化作用下通过乳酸的开环聚合制备，如图1所示。经FT-IR、13C-NMR和1H-NMR分析出的分子结构结果与之前报道[12]的一致（数据未显示）。证实后再完成扩链反应。HDI作为扩链剂（如图1）。红外光谱和核磁共振也用来分析所获得的聚氨酯的分子结构。Figure2showsthe1H-NMRspectrumofPUR-PC.Signalsat1.55and5.2wereascribedtothe-CH3and-CH2-groupsinthePLLAblocksinthesoftsegments,respectively.ThetypicalpeaksofPC,including-N+(CH3)3,-OPOCH2-and-N+CH2-werefoundat3.25,3.43and4.3,respectively[12,13].Signalsat1.3and3.15wereassignedtothe-CH2-unitsofHDIinthehardsegments[14].InFT-IRspectra,thecharacteristicabsorptionpeakof-N+(CH3)3inthesoftsegmentwasobservedat970cm-1[12,13].Thepeaksat1,528cm-1and3,405cm-1wereattributedto-NH-andNH-CO,respectively,whichwereabsentinthespectrumofsoftsegments.图2显示了PUR-PC的1H-NMR谱。在1.55和5.2信号分别归结为聚乳酸块软段的-CH3和-CH2基团。PC中典型的峰包括：N+（CH3）3、-OPOCH2-和-N+CH2基团，峰值分别在3.25，3.43和4.3处被找到[12,13]。在1.3和3.15信号峰被视为是HDI硬段中的-CH2单元产生[14]。在红外光谱中的-N+(CH3)3软段的特征吸收峰在970cm-1被吸收[12,13]。在1528cm-1和3405cm-1处的吸收峰分别归咎于NH-和NH-CO基团，其在软段谱图中不存在。Themolecularweights(MW)ofthesynthesizedpolymerswereexaminedbySEC.AsshowninTable1,thenumberaverageM(Mn)ofthesoftsegmentPC‐Swasabout2,500,itincreasedtomorethan5,000afterthechain‐extendingreaction.ThisresultonceagainconfirmedthesuccessfulsynthesisofPUR‐PCpolymer.DSCwasemployedtotestthethermalpropertiesofthepolymers.Theglasstransitiontemperature(Tg)valuesofthesoftsegmentofthePUR‐PCwasonlyabout28°C.合成聚合物的分子质量可以用SEC测定。如图1所示：PC-S软段的数均分子量大约是2500，其分子量在扩链反应后会增加到超过5000。这个结果再次证明了PUR-PC聚合物的成功合成。DSC被用来测试聚合物的热性能。PUR-PC软段的玻璃化转变温度仅仅大约为28℃。在扩链反应后它将会增加到53.3℃（见表1）。在聚氨酯中这些现象可能被解释为分子量的改善和O=C=N的基团极性导致的分子链间强的相互作用。3.2.WaterAbsorptionandBloodPlateletAdhesionTest（吸水率和血小板粘附试验）Waterabsorptionwasusedtoevaluatethehydrophilicityofthepolymers.AsshowninFigure3,thewaterabsorptionvalueofPUR‐PCwasabout6%2daysafterbeinginwater.It’sevidentlyhigherthanthatofthePURwithoutPC.Moreover,thisdifferenceincreasedovertimedurintheperiodof8days.Attheendofthetestperiod,thewaterabsorptionvalueofPUR‐PCwasaboutfivetimesofthePURwaterabsorptionvalue.吸水率用来评价聚合物的亲水性。如图3所示，在水中浸泡2天后PUR-PC的吸水率值约为6％。这显然比没有PC的PUR高。此外，这种差异随着时间的推移增加了8天。在测试结束后，PUR-PC的吸水率值约为PUR吸收率值的5倍。ThissuggestedthatbiodegradablePUR‐PCwasmorehydrophilicthanPUR.Normally,theintroductionofPCwouldimprovethehydrophilicityofpolymers.ThiswasascribedtostrongaffinitybetweenPCandwatermolecules.VariouspublishedpapershaveprovedthatthePCgroupsmigratetothesurfacesofpolymerswhencontactedwithwaterandconsequentlycombinedwithwatermolecules[12,13,15,16].这表明，可生物降解的PUR-PC比PUR亲水性好。通常情况下，引进的PC将提高聚合物的亲水性。这归因于PC分子和水分子之间强烈的亲和力。发表的各种论文证明当PC与水接触时，PC基团会迁移到聚合物的表面并与水分子结合[12,13,15,16]。Figure4showstheadherentplatelets(whitedots)onthepolymersurfaceaftercontactingwithrabbitplateletrichplasma(PRP)for60min.AlargenumberofplateletswereobservedtohaveadheredonPUR.Incontrast;muchlessplateletscouldbeseenonPUR‐PCsurface.Moreover,cellmorphologieswerefoundtobedifferentonbothofthepolyurethanesfilms.SomeplateletsonPURprotrudedflakepseudopodias,whichmadethemlargerthanthestaticplatelets(blackarrowsinFigure4).图4显示的是聚合物与兔的富含血小板的血浆接触60分钟后，其表面粘附的血小板（白点）。观察到大量的血小板粘附在聚氨酯上。与此相反，观察到少量的血小板粘附在PUR-PC表面。此外，还发现在两种不同的聚氨酯薄膜上细胞的形态有所不同。聚氨酯中一些突出的鳞片，使它们比静态的血小板大（图4黑箭头）。Incontrast,almostalltheplateletsonPUR‐PCremainedintheirinactiveroundshape.Therefore,itcouldbededucedth