人类性染色质小体的制备与观察

人类性染色质小体的制备与观察一、实验目的掌握观察与鉴别X染色质的简易方法，识别其形态特征及所在部位；鉴定个体的性别，为进一步研究人类染色体畸变与疾病的关系提供基础方法、为遗传病临床诊断提供参考。1、发现

1949年，Barr等人在雌猫的神经元细胞核中首次发现一种染色较深的浓缩小体，而在雄猫则没有这种结构。进一步研究发现，其他雌性哺乳动物（包括人类）也同样有这种显示性别差异的结构。而且不仅是神经元细胞，在其他细胞的间期核中也可以见到这一结构。一般认为这种小体是两个X染色体中的一个在间期发生异固缩形成的，故而将其称为X小体，X染色质，Barr小体（巴氏小体）或性染色质小体。Barr小体出现在哺乳动物雌性个体细胞的细胞核膜边缘，这主要是因为这条染色体处在失活状态所致，Morishima等利用放射性标记的方法证实了失活状态的性染色体与其他异染色质（heterochromatin）一样，在DNA复制时总落后于其他常染色质，且大多出现在核膜边缘。性染色质的数目是X染色体数减1。故可以根据X小体的有无、数目来鉴定胎儿的性别和性别畸形。

二、实验原理表性染色体组成与X小体数目的关系性染色体组成性别X小体的数目XY男0XO女0XX女1XXY男1XXX女2XXXX女32、莱昂假说为什么正常男女之间的X染色质存在差异？女性两个X染色体上的每个基因座的两个等位基因所形成的产物，为什么不比只有一个X染色体半合子男性的相应基因产物多？为什么某一X连锁的突变基因纯合子女性的病情并不比半合子的男性严重？20世纪60年代以来，不少学者曾提出了一些假说来解释这一现象。其中比较著名的假说是由M．F．Lyon于1961年提出的Lyon假说（Lyonhypothesis）：

1.）正常雌性哺乳动物的体细胞中，两条X染色体中只有一条在遗传上有活性，另一条在遗传上无活性。

2.）X染色体的失活是随机的。

3.）失活发生在胚胎发育早期，X染色体一经失活，其后代细胞中该染色体均处于失活状态。

4.）杂合体雌性在伴性基因的作用上是嵌合体。

3、剂量补偿：细胞内的X染色体数目超过两条时，仍只有一条保持活性，其余的都形成异固缩的X染色质。正常男性只有一条X染色体，所以X染色质的数目为0。45，XO性腺发育不全的患者虽然是女性，但是因为只有一条X染色体，所以细胞内无X染色质。一个细胞中所含的X染色质的数目等于X染色体数目减一。剂量补偿：由于雌性细胞中的两个X染色体中的一个发生异固缩（也称为Lyon化现象），失去活性，这样保证了雌雄两性细胞中都只有一条X染色体保持转录活性，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上。这种效应称为X染色体的剂量补偿。需要指出的是，失活的X染色体上基因并非都失去了活性，有一部分基因仍保持一定活性，因此X染色体数目异常的个体在表型上有别于正常个体，出现多种异常的临床证状。如47，XXY的个体不同于46，XY的个体；47，XXX的个体不同于46，XX的个体，而且X染色体越多时，表型的异常更严重。三、实验用品

1.材料口腔粘膜（男、女）、发根细胞（女）。2.器具显微镜、牙签、染色缸、盖玻片、载玻片、擦镜纸、记号笔3.试剂固定液（95%酒精：冰醋酸=3：1，盛在染色缸中）、蒸馏水、

70%、95%酒精、无水酒精、45%醋酸、5mol/LHCl、二甲苯、香柏油、卡宝品红染液。四、实验内容

1．获取实验材料A.口腔黏膜细胞取一干净的载玻片，用记号笔在即将涂细胞的一面作个标记。先用水将口漱净，尽可能除去口中的杂物。然后用牙签钝头在口腔一侧用力刮取，弃去第一次得到的刮取物，在同一部位继续刮取（这样就可取得深层的表皮细胞），将刮得的细胞涂抹在干净载玻片上，反复几将从，使玻片上的材料尽量厚些。勿令玻片上的材料干燥，迅速将玻片插入装固定液的染色缸中固定30分钟以上。如果让材料在空气中干燥，会使细胞变形。拿刚涂抹的玻片直接插入固定液中，当然会使许多材料丢失，但粘在玻片面性上的细胞足够观察之需。固定后将载玻片在空气中晾干，这样，细胞就可以紧贴在玻片的表面。B.毛囊细胞（Hairfolliclecell）拔取一根毛根比较大的毛发（头发或其他部位，如手臂上的毛发均可；如可能，尽量选用白色或浅颜色的毛发，这样在制片中就可减少色素的干扰）。在一张干净的载玻片中央滴一滴45%的醋酸，将毛根浸渍其中。静置约5分钟，待毛根稍软后用镊子尖或解剖针尖将外层毛囊的组织细胞轻轻刮下（用力太大，则可能将毛发上的色素细胞一起刮下，影响制片效果）。弃去毛干。用解剖针将载玻片上的组织细胞均匀摊平。摊平的材料在空气中晾干。2．染色1)．在晾干的玻片上直接滴上染料，染色10分钟。2)．在95%的酒精中分色1-3分钟。3)．在无水酒精中继续分色两次，每次1分钟。4)．用二甲苯透明两次，每次约3分钟，直接加盖玻片封片（或用树胶封片）后观察。3．观察观察X染色质要用油镜。人口腔X小体X小体：油镜下可见X小体为一致密的浓染小体。轮廓清晰，约1um，常附着于核膜边缘或靠边内侧，其形态有三角形、卵形、扁平形等。正常女性间期细胞核中X小体比例约30%～50%，男性中则偶尔可见（2%），且不典型。注意事项

1．刮口腔上皮前要漱口；2．刮时用灭菌玻璃片的宽边，勿用一角，以免划破口腔；3．第一次刮下的脱落细胞用酒精棉球擦去，在原位重复刮一下制片；4．盛放酒精棉球的小广口瓶，瓶盖用完即时盖好；五.结果与分析在光学显微镜下可见到X染色质为一结构致密、轮廓清楚染色较深的小体。人类的X染色质常附着于核膜内侧，这个位置就是晚复制的X染色体所处的位置（Morishima,1962）。大小约在1μm左右，呈三角形、卵形、短棒形或者双球形。一般说来，在动物细胞中，X染色质可以处于三个位置：靠近核仁，靠近核膜，或者自由地处于核区内。这种位置，对于每一种来说是相对固定的。处于核膜内侧的X染色质在压片时完全可能被压在核的中央。这种情形下，X染色质容易与核中其他的着色的结构相混。为保险计，我们通常只计数接近于核膜的小体。还应注意一个问题，并非在所有的正常女性细胞中都能看到巴氏小体，用正常女性的组织制片，统计200-400个没有破损、形态正常的细胞，可观察到具巴氏小体的细胞比率约在30%-50%。但这一比率在不同实验之间差异较大。

1．分别观察男女各50个可数细胞，计算显示X染色质所占百分比。2．观察中选绘4-5个典型细胞，示明X染色质体的形成和部位。1．X小体的观察

取材:受检查者用水漱口数次，尽可能除去细菌和食物残渣；用洁净的牙签从口腔两侧颊部刮取粘膜，第一次刮取物弃去，将第二次、第三次刮取物涂在干净的载玻片上。固定:滴加固定液（95%乙醇:乙醚=1:1或直接用乙醇）固定20～30min，空气干燥。染色制片:滴加1～2滴改良品红于室温下染色10～20min（勿使干燥），加上盖片，垫上滤纸用手指轻轻加压即可。镜检：低倍镜下计数100个核膜完整，细胞不重叠，无核固缩的细胞；并在高倍或油镜下观察。若使用女性发根细胞，需选用带有毛囊的头发（约2cm长），再加一滴染液后加上盖玻片，洒精灯上微热，静置5min，后盖一滤纸压片。

六、实验结果

2．Y小体：荧光显微镜下可见细胞核中有发亮的荧光小体，直径0.3～0.5um，正常情况下Y小体的出现率为25～50%，正常女性无，性异常者，如核型为47，XYY的个体，可见两个Y小体。

七、作业及思考题1.统计X小体的频率，画2～3个典型细胞，示X小体的形态和所处部位。2.计算出现Y小体的细胞频率。3.什么是剂量补偿效应？4.Barr小体分析技术在人类遗传学工作中有什么用途？5.在制片过程中使用HCl酸解的目的是什么？6.为什么Barr小体一般出现在核膜边缘？

四、实验步骤1.口腔颊部粘膜细胞巴氏小体观察刮取颊部粘膜上皮细胞（用灭菌玻璃片）→涂片（两片45°角）→60%冰醋酸固定5分钟→吸去冰醋酸，用改良苯酚品红染色1-2分钟→压片→镜检。2.发根细胞巴氏小体观察拔取带毛囊头发一段→45%冰醋酸解离5分钟→剥取毛囊→染色2-3分钟→压片。3.观察在女性间期细胞核内侧靠近核膜处有约1微米大小的反光极强的颗粒状亮点，即为巴氏小体。材料不同，观察结果可能有不同，且必须和核仁区别开来（核仁往往离核膜较远或接近核中央部位）。五、作业1．分别观察男女各50个可数细胞，计算显示X染色质所占百分比。2．观察中选绘4-5个典型细胞，示明X染色质体的形成和部位。正常女性口腔粘膜细胞中约30-50%有一个巴氏小体，男性则低于1-2%。一、实验目的学习X染色质的标本制作。观察X染色质、形态特点。了解人类染色体G显带技术方法二、实验原理在间期，女性体细胞中两条X染色体中的一条异染色质化。用Giemsa染色法可使其着色，本方法的优点是只有细胞核清晰着色，胞浆不着色，因此细胞核背景清晰，利于对位于核膜边缘的X染色质的辨认。Giemsa染料是由噻嗪和曙红组成的，着色时DNA先与2个噻嗪分子结合，然后再与一个曙红分子结合，形成沉淀物，而DNA的某些部位对染料不敏感，由此形成明暗相间的条带。G显带的方法很多，最常用的是将已固定的染色体制片进行预处理，再用Giemsa染色。预处理的方法非常多，可用热、碱、各种蛋白酶、尿素等，其中最常用的是胰蛋白酶进行预处理。方法简便，周期短。G显带区的DNA有较丰富的A-T对，有相当一部分中度重复序列DNA可能在G带区，Giemsa染料在G带区的结合与其相应的DNA和非组蛋白有关。

三、实验方法与步骤1,制备：G-带胰酶消化法外周血培养常规法制作染色体标本，置60℃烘箱烘8h～10h，或80℃烘3h，然后置37℃烘箱烘3d左右即可予处理。置0.02%胰蛋白酶溶液入染色缸，加入0.4%酚红2滴，并以3%三羟甲基氨基甲烷液调节pH为6.4～6.6，37℃水浴。将烤三天的玻片从37℃烘箱取出，投入0.02%胰蛋白酶溶液中，并不断摆动，2.5min左右。取出自来水冲洗。染色：Giemsa染液（