血吸虫感染后宿主免疫反应状态的分析 Biology of liver

血吸虫感染后宿主免疫反应状态的分析

Biologyofliver

主讲人：沈际佳职称：教授邮箱：shenjijia@单位：安徽医科大学病原生物学教研室一、目的和要求1.熟悉血吸虫感染后宿主对血吸虫感染的免疫应答。2.了解肝脏纤维化程度染色方法的实验原理及操作步骤。二、实验材料

1.实验动物：日本血吸虫感染阳性钉螺30只、体重1.5~2kg的家兔2只；2.实验试剂：Ig抗体亚型检测试剂盒、IFN-γ与IL-4ELISA试剂盒、小牛血清、丽春红、酸性品红液、苯胺蓝液（亮绿液）磷钼酸；3.实验器材：烧杯、离心管、EP管、微量加样器、显微镜、全自动酶标仪、37℃孵育箱。三、实验内容1.动物感染（1）钉螺逸蚴实验:日本血吸虫的阳性钉螺30只置100ml脱氯自来水的烧杯中，室温，光照条件下逸尾蚴3~4h。（2）兔感染实验:新西兰兔10只(2kg)。腹壁皮肤贴片法感染血吸虫，2000条尾蚴/只。用接种环挑取尾蚴在盖玻片上，解剖镜下反复观察计数。用棉绳捆绑家兔四肢，腹部向上固定在实验台板上，去除腹部皮毛约2~3块盖玻片大小，用脱氯自来水湿润并擦洗,将粘有尾蚴的盖玻片敷于去毛皮肤上。20min后取下盖玻片，松开捆绑绳子放入兔笼。2.标本采集（1）血清采集分别于感染前、感染后2周、感染后4周、感染后6周兔耳缘静脉采血并分离血清，-20℃保存备用于Ig型与亚型的鉴定。（2）肝脏病理切片取感染前、感染后6周兔部分肝脏，固定后分别制作成石蜡切片，备用于纤维化程度染色。3.抗体及细胞因子检测（1）Ig型与亚型的鉴定参照检测试剂盒说明书，采用抗原介导ELISA法测定感染兔血清中Ig的类型和亚型。详细步骤如下：①包板：pH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗血吸虫成虫粗抗原（AWA）至10μg/ml，100μl/孔，4℃湿盒过夜；②封闭：次日弃去包被液，PBST洗涤酶标反应孔4次，每次5min，甩干，5%小牛血清300μl/孔封闭，4℃湿盒过夜；③弃去封闭液，同上洗涤，PBS稀释成1:1000的兔血清（感染前，感染后2、4、6周）样品100μl/孔，同时设立空白，阳性和阴性对照，37℃湿盒温育1.5h；③弃去封闭液，同上洗涤，PBS稀释成1:1000的兔血清（感染前，感染后2、4、6周）样品100μl/孔，同时设立空白，阳性和阴性对照，37℃湿盒温育1.5h；④弃去血清样品，同上洗涤，PBS稀释成1:100的HRP-羊抗兔各型与亚型Ig100μl/孔，37℃温育1h；⑤弃去酶标二抗，同上洗涤，TMB显色底物A和B各50μl/孔，37℃避光显色10min，每孔加入50μl2mol/LH2SO4终止液，全自动酶标仪测定450nm处的吸光度A值。（2）按照IFN-γ与IL-4ELISA试剂盒的操作说明书检测兔血清的IFN-γ与IL-44.纤维化程度检测（Masson染色）（1）切片脱蜡至蒸馏水（2）苏木素染5~10min（3）盐酸酒精分化（4）流水蓝化，蒸馏水洗（苏木素可不染）（5）丽春红酸性品红液中染5~8min（6）蒸馏水洗（7）7.1%磷钼酸中染1~3min（8）不用水洗直接入苯胺蓝液或亮绿液5min（如染色效果不佳，可在冰醋酸内脱色后重染）（9）水速洗，置60℃温箱中烘干，二甲苯透明，封固。四、结果观察与分析1.Ig型与亚型2.IFN-γ与IL-43.纤维化染色结果分析

0级（20=1）为基本正常；Ⅰ级（21=2）为胶原纤维包绕虫卵肉芽肿周围；Ⅱ级（22=4）为汇管区有大量纤维，小叶间仅有少量纤维；Ⅲ级（23=8）为纤维组织大量延伸至肝小叶间。

五、作业与思考题1.