分子生物学在检验医学中的应用

分子生物学在检验医学中的应用1精选课件

一、分子生物学在检验医学中的常用技术

1、

PCR技术2、

RT-PCR技术3、

RFLP4、

SSCP5、

MSP6、

测序2精选课件

二、外源性疾病的检验与诊断：

1、

细菌、支原体、衣原体、寄生虫、病毒等2、

SARS冠状病毒的分子生物学检测3精选课件4精选课件5精选课件BNIoutS/BNoutAs:

senseATGAATTACCAAGTCAATGGTTAC

antisenseCATAACCAGTCGGTACAGCTAC

FraGmentlenGth195bp

BNIinS/BNIAs:

senseGAAGCTATTCGTCACGTTCG

antisenseCTGTAGAAAATCCTAGCTGGAG

Fragmentlength110bp

SAR1s/SAR1as:senseCCTCTCTTGTTCTTGCTCGCA

antisenseTATAGTGAGCCGCCACACATG

Fragmentlength150bp

6精选课件Ampliconsequence(BNI-1,Bernhard-NochtInstitute,Hamburg,Germany)TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC

7精选课件SARS-specificprimers:

Cor-p-F2(+)5'CTAACATGCTTAGGATAATGG3',

Cor-p-F3(+)5'GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC3',

Cor-p-R1(-)5'CAGGTAAGCGTAAAACTCATC3',

Productsize:

Cor-p-F2/Cor-p-R1:368bp

Cor-p-F3/Cor-p-R1:348bp

8精选课件GovernmentVirusUnit

9/FPublicHealthLaboratoryCentre

382NAmCheongStreet

ShekKipMei

Kowloon,HongKongSAR

HongKong-SARChina

COR-1,COR-2:sense5'CACCGTTTCTACAGGTTAGCTAACGA3'

antisense5'AAATGTTTACGCAGGTAAGCGTAAAA3'

Productsize:310bp9精选课件QueenMaryHospital

TheUniversityofHongKong

UniversityPathologyBuilding

HongKong-SARChina

HKU:sense5'TACACACCTCAGCGTTG3'

antisense5'CACGAACGTGACGAAT3'

Productsize182bps10精选课件

二、内源性疾病的检验与诊断：

1、

临床基因变异酶的分子性质研究

1）

用PCR-SSCP技术发现我国第一例

LDH遗传变异病例11精选课件

病例

21岁男性：

LDH：75U/L(参考范围：110-240U/L)其余指标均正常在三年的调查期间，LDH活力始终处于较低水平，在48-85U/L之间12精选课件

经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的影响等可能因素外，我们怀疑可能有遗传性的LDH变异。根据计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断定为H亚基变异，采用合成的7对引物，分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异发生在外显子4上，由此证明该病人的长期低酶活力是有基因变异引起的。13精选课件

2n2

3n3

4n4

5n5

6n6

14精选课件2）LDH-A和LDH-B亚基遗传变异及

对检验结果的影响

基因变异可导致酶分子组成结构发生变化，对酶活力和酶的物理化学性质造成影响，可给临床医生造成诊断陷阱(pitfall)，因为在不同疾病状态下，从相关联的组织器官中释放出的酶与预期的不同，病人血清酶活力不能完全反映各种疾病的状态，容易造成误诊。15精选课件

LDH-A基因变异类型_________________________________________________变异位置DNA氨基酸置换影响—————————————————————————A-171CGA-TGAArg-Ter无义突变A-328GAG-TAGGlu-Ter无义突变A-81GAC-AACAsp-Asn外显子2丢失A-220AAA-GAALys-Glu电荷变化A-314CGT-TGTArg-Cys电荷变化A-20插入C移码突变A-128TGTTGT-TGTValVal-Val辅酶结合A-213丢失2bp(CT)移码突变A-251丢失20bp移码突变—————————————————————————16精选课件

LDH-B基因变异类型

变异位置DNA氨基酸置换影响

B-6AAA-GAALys-Gly电荷变化B-35GCC-GAGAla-Glu辅酶结合B-1038bp重复移码突变B-131AGT-CGTSer-Arg辅酶结合B-139丢失2bp(TC)移码突变B-1454bp重复移码突变B-147TAT-TAGTyr-Ter无义突变B-171CGC-CCCArg-Pro基质结合B-172TTT-GTTPhe-Val基质结合B-173CGC-CACArg-HisP轴的安定性B-176ATG-TTGMet-Leu分子稳定性B-287丢失1bp(C)移码突变B-320GAT-GTTAsp-Val电荷变化

17精选课件

3)

CK变异的分子性质及对酶活力的影响

病例56岁妇女，胸痛一天后被送入急诊科心电图和临床症状提示AMI实验室检查：

LDH6900U/L(200-400U/L)LDH-1/LDH-21.72CK37U/L(15-130U/L)CK-MB0U/L

18精选课件RT-PCR结果19精选课件20精选课件外显子2残基54处

A–GGAC–GGC

天冬氨酸–甘氨酸

位于酶结构的第4个α-螺旋21精选课件

4）变异酶人群的检验结果不同于常

规人群的检验结果

结合临床研究发现变异酶的检验结果与常人存在着显著的差异，即这类人群发病前酶活力常低于正常人的参考范围，发病时则上升至正常人的参考范围之内，这个现象可能给临床医生正确诊断造成困难；22精选课件1）

2、

2、电泳异常带的分子性质研究23精选课件1）

LDH异常电泳酶谱M4H1M3H2M2H3M1H4(+)LD-5LD-4LD-3LD-2LD-1

︱︱︱︱︱

正常

︱H缺失

︱M缺失

︱︱︳︱︳︱︳︱︳H变异(slow)

︱︱︳︱︳︱︳︱︳H变异(fast)

24精选课件H发生变异时，产生H和hM4H1M3H2M2H3M1H4LD-5LD-4LD-3LD-2LD-1︱H1M3h1M3H2M2H4h2M2h1H3hHM2h2H2h3H1h4

25精选课件26精选课件27精选课件2）

异常电泳酶谱的分子性质1）核苷酸的变异引起氨基酸的改变，

2）变异后的氨基酸的酸碱性与变异前的氨基酸的酸碱性不同，

3）变异的氨基酸位于分子的表面。

结果：产生异常的电泳结果28精选课件

3）

异常谱形的分析方法29精选课件LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图血清（浆）同工酶分析（异常形式）红细胞、白细胞同工酶分析正常谱型异常谱型免疫对流、固定、混合法鉴定遗传变异（H或M亚基变异）

（+）（-）

LDH-Ig复合物肿瘤产生LDH基因分析

30精选课件LDHH/M比值的计算--------------------------------------------------------

LDH-1LDH-2LDH-3LDH-4LDH-5H亚基数43210M亚基数01234%ABCDE----------------------------------------------------------------------------------