刘士东主任讲解分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用

分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用刘士东主任医师中国人民解放军316医院第一页，共66页。肿瘤靶向治疗

〔Targettherapyofcancer〕根据肿瘤发生的异常分子和基因，设计和研发针对这些特定的分子和靶点药物，选择性杀伤肿瘤细胞的治疗方法；靶向治疗的前提就是明确肿瘤的特异靶基因变异类存在与否和变异类型；个体化治疗的雏形。第二页，共66页。荧光原位杂交〔Fluorescenceinsituhybridization，FISH〕技术

第三页，共66页。简介FISH=FluorescenceInSituHybridization利用荧光标记的DNA探针检测组织或细胞内与其互补的DNA片段应用：遗传病诊断血液肿瘤实体瘤样本：羊水、绒毛、流产组织、外周血、骨髓、体液及各种肿瘤组织等第四页，共66页。用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位荧光标记探针探针变性样本DNA变性杂交工作原理第五页，共66页。FISH检测染色体易位〔Translocation〕在淋巴瘤分型中的应用FISH技术在淋巴造血系统肿瘤中的应用第六页，共66页。检测技术特点不同类型的淋巴瘤染色体易位类型不同优点适用于形态学上难以诊断且IHC结果不理想的标本；适用于细胞数量少，形态不典型的活检及穿刺组织。必须结合组织形态学和免疫组化结果作最后诊断！！！第七页，共66页。FISH基因检测在淋巴瘤的应用第八页，共66页。弥漫大B细胞淋巴瘤〔DLBCL〕按免疫组化亚型分为CD5阳性DLBCL生发中心B细胞样变型(GCB)、非生发中心B细胞样变型(non-GCB)3类可根据CD10、BCL6、MUM1的表达区分生发中心B细胞样变型、非生发中心B细胞样变型。>30%瘤细胞表达CD10或CD10(-)、BCL-6(+)、MUM-1(-)诊断为GCB;其他病例那么为non-GCB。第九页，共66页。◆BCL6基因断裂---辅助诊断弥漫性大B细胞淋巴瘤◆BCL6基因断裂重排----判断预后目前研究确定至少40%的DLBCL涉及BCL6基因重排。

一项针对102名DLBCL患者的BCL6重排情况及其与预后关系的研究显示，BCL6阳性患者诊断治疗36个月后，疾病停顿开展的比率为82%，携带有BCL6重排的病例预后较好。BCL6基因断裂与弥漫性大B细胞淋巴瘤第十页，共66页。第十一页，共66页。Offit,K.NEnglJMed,1994.331(2):p.74-80.结果判读第十二页，共66页。IGH/CCND1交融基因可见于95%的套细胞淋巴瘤，是套细胞淋巴瘤与其他淋巴瘤鉴别的重要指标。IGH/CCND1交融基因--辅助诊断套细胞淋巴瘤。IGH/CCND1交融基因与套细胞淋巴瘤第十三页，共66页。l正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。l异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两个交融信号。第十四页，共66页。API2/MALT1基因检测试剂盒

探针：GLPAPI2/GLPMALT1凋亡抑制因子2基因〔apoptosisinhibitor-2,API2〕,位于11号染色体;粘膜相关淋巴组织基因〔Mucosa-associatedlymphoidtissue1,MALT1〕，位于18号染色体。

API2基因与MALT1基因的交融导致凋亡抑制的增加，引起细胞不依赖于抗原刺激的生存优势。第十五页，共66页。API2/MALT1交融基因的检测可以指导抗HP治疗胃MALT淋巴瘤与幽门螺旋杆菌〔HP〕感染导致的慢性胃炎有关，MALT1/API2交融基因阴性的患者抗HP治疗有效，阳性患者抗HP治疗无效。API2/MALT1交融基因检测意义第十六页，共66页。l正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。l异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两个交融信号。第十七页，共66页。BCL2/IGH重排发生在约80%-85%的FL患者中，检测BCL2/IGH基因重排可以辅助诊断FL。

BCL2/IGH阴性的FL患者3年生存率为100%，而阳性者只有54%；阴性者3年疾病无进展为87.5%，而阳性者只有13%。BCL2/IGH交融基因与滤泡性淋巴瘤BCL2/IGH交融基因-----辅助诊断滤泡性淋巴瘤BCL2/IGH交融基因-----判断预后第十八页，共66页。l正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。l异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两个交融信号。第十九页，共66页。结果判读-阳性结果第二十页，共66页。结果判读-阳性结果第二十一页，共66页。

约80%的伯基特淋巴瘤病例发生t(8；14)〔q24;q32〕；约15%的伯基特淋巴瘤病例发生t(2；8)(p11;q24)；约5%发生t(8；22)〔q24;q11〕。染色体易位导致C-MYC基因断裂重组可能是伯基特淋巴瘤的一个标志，可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅助诊断。C-MYC基因断裂与伯基特淋巴瘤辅助诊断伯基特淋巴瘤

第二十二页，共66页。第二十三页，共66页。结果判读-阳性结果第二十四页，共66页。FISH技术在乳腺癌靶向治疗应用第二十五页，共66页。乳腺癌

Her-2基因致癌基因：Her-2基因；位点：17q11.2-q12；编码蛋白：跨膜蛋白〔与表皮生长因子受体部分同源〕；25-30%乳腺癌病人都有HER-2的扩增；HER-2基因扩增是决定Herceptin治疗是否有效的关键性指标。HER2扩增的乳腺癌更具有侵袭性生长才能。第二十六页，共66页。乳腺癌Her-2基因及蛋白检测Cerb-B-2:3+

完全强膜阳性细胞>30%

2+,1+,-

FISH检测是否有基因扩增第二十七页，共66页。Her2基因检测流程石蜡组织标本IHC检测再用FISH方法检测—1+3+2+—+Herceptin治疗+再用FISH方法检测Herceptin治疗FISH检测+—再用FISH方法检测+第二十八页，共66页。A.无须计数的大簇团信号（高度扩增）B.颗粒状信号（R>10，高度扩增）C.须计数的颗粒状信号（R=3.5，低度扩增）ACBHer-2基因扩增状况第二十九页，共66页。>30%的肿瘤细胞全部的细胞膜高强度着色免疫组化（3+）与FISH对比×40×100浸润性导管癌Ⅱ级IHC：+++FISH：呈簇团状高度扩增×100第三十页，共66页。免疫组化（－）与FISH扩增阳性浸润性导管癌Ⅱ级IHC：－FISH：呈簇状扩增肿瘤细胞不着色×40×100第三十一页，共66页。基因突变检测方法第三十二页，共66页。1.RNA酶A切割(RnaseAcleavage)2.变性梯度凝胶电泳(DGGE)3.杂合双链分析法(HA)4.化学切割错配(CCM)5.碳化二亚胺检测(Carbodiimide,CDI)6.酶促切割错配(EnzymeMismatchCleavage,EMC)7.单链构象多态性(Single-StrandConformation)8.切割片段长度多态性9.DNA测序(Sequencing)10.双脱氧指纹图谱法(DideoxyFinger-printing,ddF)11.错配接合蛋白检测12.蛋白截短测试〔proteintruncationtest〕方法第三十三页，共66页。13.变性的高效液相色谱检测(DenaturingHighPerformanceLiguldChromatographyDHPLC)14.DNA芯片技术(DNAchip)16.等位基因特异性寡核苷酸片段分析(Allele-SpecificOligonucleotide,ASO)17.引物延伸检测(PrimerExtension,PEX)18.寡核苷酸连接检测(OligonucleotideLigationAssay,OLA)19.限制性片段分析(RestrictionFragmentAnalysis〕20.突变体富集PCR法〔mutant-enrichedPCR〕21.蝎形探针扩增阻滞突变系统〔Scorpionsamplificationrefractorymutationsystem〕第三十四页，共66页。肺癌组织EGFR基因扩增和

突变检测及其临床意义第三十五页，共66页。研究背景研究显示吉非替尼对部分晚期NSCLC患者的治疗效果非常显著。存在EGFR基因突变的患者更有可能对吉非替尼的治疗敏感。存在EGFR基因扩增的肺癌、肠癌病人对分子靶点药物更为敏感。检测大肠癌有无EGFR过度表达，只要>1%的癌细胞的胞膜强阳性染色即判断为3+，可作为应用西妥昔单抗的指征。第三十六页，共66页。FISH检测EGFR基因扩增标本类型：石蜡包埋组织〔手术、活检、穿刺〕冰冻组织胸、腹水沉渣细胞探针类型：GLPEGFR/CSP7定量PCR检测EGFR基因突变分型突变类型：19exon〔2235-2249位点〕15bp缺失突变19exon〔2240-2257位点〕18bp缺失突变19exon〔2240-2251位点〕12bp缺失突变21exon2573位点T>G碱基置换突变21exon2582位点T>G碱基置换突变

EGFR基因变异检测第三十七页，共66页。第三十八页，共66页。双体性三体性多体性扩增EGFR基因FISH检测状况肺癌石蜡第三十九页，共66页。第四十页，共66页。

FQ-PCR分型技术检测EGFR突变第四十一页，共66页。存在EGFR突变肺癌样本的琼脂糖凝胶电泳图71例肺癌组织中检测出6例突变样本第四十二页，共66页。FQ-PCR检测15bp缺失阳性病例结果

红色阈值线以上的扩增曲线即为阳性标本的扩增曲线，按荧光信号值的上下依次为9号、12号、13号、55号、38号和33号标本第四十三页，共66页。15bp缺失突变型DNA的测序图

senseantisense第四十四页，共66页。红色阈值线以上的扩增曲线即为阳性标本的扩增曲线，按荧光信号值的高低依次为2号、36号、和40号标本FQ-PCR检测18bp缺失阳性病例结果第四十五页，共66页。目前K-RAS突变检测常用技术第四十六页，共66页。方法直接测序焦磷酸测序高分辨率熔解曲线PCR-RFLP芯片杂交Real-TimePCR第四十七页，共66页。肿瘤组织确实认和挑选显微切割肿瘤提取DNA相应的PCR反响或杂交相关的分析和检测K-ras突变检测根本流程图第四十八页，共66页。直接测序(DirectSequencing)PCR扩增后产物直接测序双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到别离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测第四十九页，共66页。第五十页，共66页。K-ras突变检测结果第五十一页，共66页。疗效预测标志物与预后判断标志物疗效预测标志物： 可以预测某种特定治疗方式疗效的标记物KRAS基因突变导致肿瘤对EGFR抑制剂抵抗预后判断标志物： 在不考虑治疗因素的情况下可以判断患者结局的标记物18号染色体长臂〔18q〕缺失某些分子标志物兼具两种作用胸腺嘧啶合成酶〔Thymidylatesynthase〕第五十二页，共66页。EGFR作为预后因子的价值EGFRexpressioncorrelateswithpoorprognosisDFS=Disease-freesurvival;OS=overallsurvival第五十三页，共66页。Cetuxamab(西妥昔单抗)人源化嵌合单抗〔IgG1〕靶向作用于表皮生长因子受体〔EGFR〕阻断EGF和TGFα与EGFR的结合，抑制酪氨酸激酶活性和其后的肿瘤生长200４年获得FDA审批资格治疗结直肠癌Panitumumab〔帕尼单抗〕完全人源化单克隆抗体(IgG2)靶向作用于表皮生长因子受体〔EGFR〕2005年7月获得FDA快速通道审批资格治疗结直肠癌结直肠癌分子靶向治疗药物

第五十四页，共66页。KRAS突变KRAS突变可不依赖EGFR受体途径，自行激活RAS/MAPK通路导致ERBITUX耐药KRAS突变与Erbitux疗效及患者生存相关KRAS突变并非孤立事件KRAS突变常伴随BRAF突变，并与CpG岛甲基化表型(CIMP)1,2相关KRAS突变常伴随PI3K突变3LièvreA,etal.JClinOncol;26:374–379MAPK=mitogen-activatedproteinkinase第五十五页，共66页。K-ras基因野生型患者能从这类药物治疗中获益。K-ras基因突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益,反而徒增不良反响危险和治疗费用；抗EGFR治疗和K-ras突变互相排斥K-ras基因抗EGFR治疗关系亲密第五十六页，共66页。年7月FDA批准了对西妥昔单抗和帕尼单抗说明书标签的修改：

结直肠癌分子靶向治疗药物

注明KRAS基因突变的结直肠癌患者不推荐这使用这两种用药物。

第五十七页，共66页。K-ras基因突变:20-60%结直肠癌K-ras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，原发灶和转移灶的K-ras基因高度保持一致K-ras基因突变第五十八页，共66页。NCCN临床理论指南指南明确指出所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态。美国美国临床肿瘤学会(ASCO)推荐把K-ras基因突变检测作为结直肠癌患者承受EGFR单抗治疗的预测指标。欧盟药品审评管理局规定：cetuximab及panitumumab用于mCRC的治疗前，患者必须确定为K-ras野生型。K-ras与结直肠癌治疗第五十九页，共66页。结直肠癌〔C