葡萄糖钳夹技术的建立

葡萄糖钳夹技术的建立葡萄糖钳夹技术的建立【摘要】目的：建立能精确测定胰岛素敏感性的高胰岛素?正常葡萄糖钳夹技术.方法：应用高胰岛素?正常葡萄糖钳夹技术对10名正常体质量、正常糖耐量的健康志愿者进行方法学研究.结果：钳夹试验开始后，血浆胰岛素浓度迅速上升并维持在100mU/L左右，空腹血糖维持在正常水平(5.0mmol/L),试验过程中内源性胰岛素和肝糖源输出得到完全抑制，血液升糖激素浓度(包括皮质醇和生长激素)与基础值相比无明显上升.钳夹稳态期，葡萄糖输注率为(11.56±1.74)mg/(kg・min).结论：高胰岛素?正常葡萄糖钳夹技术已成功建立.在高胰岛素?正常葡萄糖稳态条件下，葡萄糖输注率等于机体的葡萄糖利用率，葡萄糖输注率可以作为评价组织对外源性胰岛素敏感性的指标.【关键词】胰岛素葡萄糖钳制技术胰岛素抗药性胰岛素敏感性引言高胰岛素?正常葡萄糖钳夹技术(hyperinsulinemic?euglycemicclamp)是目前世界上公认评价机体胰岛素敏感性的金标准，已在基础及临床医学研究领域中得到广泛应用，并且已扩展应用于许多病理状态、药物或非药物防治措施的机制研究中.建立和开展高胰岛素?正常葡萄糖钳夹技术对于糖尿病基础和临床研究具有重要意义，但由于此方法操作复杂、价格昂贵且费时，国内仅有数家医院开展此技术.我院内分泌科自2006年引进葡萄糖钳夹系统以来，根据DeFronzo等⑴所建立经典钳夹技术的原理并结合国内外近年来的研究进展，成功建立了高胰岛素?正常葡萄糖钳夹技术.1对象和方法1.1对象10(男5，女5)名正常健康志愿者，年龄27.0±4.4(23~37)岁，体质量指数20.3±1.2(19.2~23.2)kg/m2，无糖尿病、高血压病家族史，血脂谱正常，肝、肾功能及血尿酸浓度均在正常范围，未服用任何可能影响胰岛素敏感性的'药物，口服75g葡萄糖耐量试验均为正常糖耐量者(按2003年ADA标准).试验前3d受试者每日碳水化合物饮食不少于200g,体质量保持稳定.试验前向受试者解释试验的性质、目的及可能发生的不良反应，所有受试者均自愿参加试验并签署知情同意书.1.2方法受试者检查前空腹12h，早8:00到达检查室，测量身高、体质量，排空小便后清醒静卧于检查床30min后开始试验.先分别于受试者双侧前臂行静脉穿刺，利用三通管组成2条静脉通道.一侧用于输注胰岛素及200mL/L葡萄糖液(连接于InjectomatC?IS和INCA?ST容积泵，德国Fresenius公司)；另一侧用于试验中采血(将此侧前臂置于60°C恒温仪中，以保证静脉血动脉化[2]),不采血时缓慢静滴生理盐水，采血前临时关闭输液器.钳夹开始10min内以4mU/(kg・min)速率输注人胰岛素溶液(诺和灵R,40000U/L，丹麦NovoNordisk公司)使血液胰岛素浓度迅速升高，随后110min内以2mU/(kg・min)速率持续输注.在此期间每5min测一次静脉血糖值(BIOSEN5030血糖分析仪，葡萄糖氧化酶电极法，德国)，根据血糖值调整200mL/L葡萄糖液输注率，使受试者血糖值维持在5.0mmol/L左右.每10min采静脉血测定血清胰岛素浓度，每30min测定血清C肽、皮质醇和生长激素浓度(化学发光法，药盒购自天津德普诊断产品有限公司).试验结束时收集试验期间尿标本，测定尿糖值(测定方法同血糖测定).所有血标本均经离心分离血清，-80C冰箱保存至同批测定.统计学处理：试验结束后计算各受试者试验中血糖值均数(x)、标准差(s)及变异系数(CV)，计算试验中每10min的平均葡萄糖输注率(glucoseinfusionrate,GIR)、机体总葡萄糖利用率(钳夹开始20~120min内平均GIR)和最大葡萄糖利用率(钳夹稳态期最后30min平均GIR).全部数据均采用SPSS13.0软件处理，计量资料以x±s表示，不同性别之间比较采用两独立样本t检验.2结果全部受试者均成功完成钳夹试验，检查结束后均未发生低血糖反应及其他异常反应，静脉穿刺部位未发生感染及静脉血栓形成.结果显示高胰岛素?正常葡萄糖钳夹技术成功建立.2.1外源性胰岛素?葡萄糖代谢稳态形成基础血浆葡萄糖浓度为(4.26±0.39)mmol/L，在高胰岛素?正常葡萄糖钳夹过程中，血糖稳定在(4.99±0.15)mmol/L，稳态期血糖CV为(3.09±1.29)%.基础血清胰岛素浓度为(3.81±2.20)mU/L，钳夹试验开始后血清胰岛素浓度迅速升高，于10min时达到高峰(133.70±21.91)mU/L，随后维持在(91.57±13.86)mU/L至试验结束.基础血清C肽浓度为(1.92±0.34)Ug/L，整个钳夹过程中C肽浓度为(1.32±0.35)ug/L，各个时点的C肽浓度与基础状态相比呈逐渐下降趋势(图1).钳夹稳态期与基础状态相比较，升糖激素如血皮质醇、生长激素的浓度无明显上升，且均呈逐渐下降的趋势(图2).2.2高胰岛素?正常葡萄糖钳夹过程中的血糖及葡萄糖输注率变化钳夹试验过程中受试者血糖浓度稳定在(4.99±0.15)mmol/L，试验开始40min内GIR上升较快，达到(9.45±3.17)mg/(kg・min)，此后上升趋于平缓，在90~120min时均保持在稳态(图3).钳夹开始20~120min内GIR为(10.75±2.38)mg/(kg・min)，稳态期GIR为(11.56±1.74)mg/(kg・min)，不同性别之间GIR[男(10.53±1.57)mg/(kg・min)，女(12.25±1.59)mg/(kg・min)]差异无统计学意义(P=0.12).3讨论1966年Andres依据糖代谢特点设计了高胰岛素?正常葡萄糖钳夹技术，1979年DeFronzo等［1］对该技术作了详细研究并应用于人体，从此推动了葡萄糖钳夹技术在世界范围内的应用，成为目前公认评价机体胰岛素敏感性的“金标准”.本研究按照DeFronzo等［1］的方法进行设计，结果显示形成稳定高胰岛素状态，达到完全抑制肝脏内源性葡萄糖输出的目的;血糖钳夹在正常水平，变异系数小于5%;试验中内源性胰岛素分泌被抑制，升糖激素无明显释放，符合高胰岛素?正常葡萄糖钳夹技术成功建立的标准［1］.正常人体内胰岛素浓度高于生理水平时肝糖输出可以被完全抑制，故钳夹试验中当达到高胰岛素稳态时外源性葡萄糖输注率(GIR)等于外周组织的葡萄糖利用率(M值)，此时GIR可作为评价机体胰岛素敏感性的指标