《多聚酶链式反应扩增DNA片段》设计 市赛一等奖

《多聚酶链式反应扩增DNA片段》教学设计课题目标（一）知识与技能1．了解PCR技术的基本操作2．理解PCR的原理3．讨论PCR的应用（二）过程与方法在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件（三）情感、态度与价值观通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神课题重点PCR的原理和PCR的基本操作课题难点PCR的原理教学方法启发式教学教学工具多媒体课件教学设计1.回顾上节课凝胶色谱法和电泳的原理。2.掌握凝胶色谱法分离蛋白质的操作以及电泳操作过程。知识准备凝胶色谱法和电泳的原理教材助读血液的组成成分水分血浆无机盐、葡萄糖等血液白细胞血细胞血小板两个α-肽链红细胞血红蛋白两个β-肽链最多四个亚铁红素基团（二）实验操作1.样品处理：通过洗涤红细胞、血红蛋白释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液。试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。2.样品的粗分离方法：透析原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内目的：除去样品中分子量较小的杂质。3.样品的纯化：通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去（1）凝胶色谱柱的制作：①、取长40厘米，内径厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②、底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③、顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④、组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤、安装其他附属结构（2）凝胶色谱柱的装填①、凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水克。②、凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。③、凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2.装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。3.洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为）充分洗涤平衡12小时。注意：1.液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2.不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。（3）样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。④洗脱：小心加入pH=的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。4.样品的纯化鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定课内探究质疑探究洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水?在血红蛋白释放过程中。加入蒸馏水和甲苯的目的是什么?与其他真核细胞相比较，红细胞有什么特点？这一特点对分离有什么意义/实验操作中透析的目的是什么？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？归纳总结血红蛋白提取分离：首先，洗涤红细胞，释放血红蛋白、离心；然后通过透析将样品粗分离；再制作凝胶色谱柱进行样品纯化；最后，SDS凝胶电泳鉴定样品是否为血红蛋白。知识网络图样品处理洗涤红细胞，释放、离心。样品的粗分离透析血红蛋白的提取与分离样品的纯化凝胶色谱柱样品的鉴定SDS凝胶电泳当堂检测1．蛋白质提取和分离分为哪几步（）A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定2.血红蛋白因含有什么物质而呈红色（）A.O2B.COC.CO2D.血红素3.将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（）A.甲苯B.血红蛋白水溶液C.脂溶性物质的沉淀层D.其他杂质的沉淀4．分离血红蛋白溶液时，离心后试管中的溶液分四层，血红蛋白位于（）A．一B．二C．三D．四5.下列操作正确的是（）A.分离红细胞时采用低速长时间离心B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心D.透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h6．洗涤红细胞的目的是（）A．去除血清B．去除杂蛋白C．除去血小板D．除去水7．洗涤红细胞时，分离所用的方法为（）A．低速长时间离心B．低速短时间离心C．高速长时间离心D．高速短时间离心8．制作凝胶色谱柱时，橡皮塞顶部凹穴内插入的移液管的部位及长度是（）A．移液管头部5cmB．移液管尾部5cmC．移液管头部3cmD．移液管尾部3cm9．下列有关凝胶色谱法中样品的加入和洗脱的叙述中，正确的是（）A．先加入1mL透析后的样品B．加样前要使缓冲液缓慢下降，全部流出C．如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功D．洗脱时可以用缓冲液也可以用清水课后训练一、单选题1．装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应（）A．先打开后关闭B．关闭C．先关闭后打开D．打开2．D亚铁血红素基团可携带（）A．一分子COB．一分子NOC．一分子O2或CO2D．一分子NO23．人体正常的血红蛋白中应含有Fe2+，若误食亚硝酸盐，则导致血红蛋白中的Fe2+。转化为Fe3+，产生高价铁血红蛋白而中毒。服用维生素C可解除亚硝酸盐中毒。在维生素C参与的反应中（）A．亚硝酸盐是还原剂B．维生素C是氧化剂C．亚硝酸盐被氧化D．维生素C将Fe3+还原为Fe2+4．加有少量柠檬酸钠(防止血液凝固)的猪血分装于标号①、②、③的试管中，随后依次加入质量分数为0．3％、0．9％和1．5％的氯化钠溶液稀释，30min后离心。下列叙述中，正确的是（）A．①和②试管的上清液中有血红蛋白，沉淀中都有红细胞B．②和③试管的上清液呈淡黄色，沉淀中均有皱缩的红细胞C．①和③试管的沉淀中分别有红细胞的碎片和皱缩的红细胞D．②和③试管的上清液是血清5．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是（）A．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和C．防止血红蛋白被02氧化D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能6．在盛有红褐色的Fe(OH)3，胶体的U形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐加深，这说明（）A．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阴极移动B．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阳极移动C．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阳极移动D．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阴极移动7.下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（）A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化D.可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度8.凝胶色谱法操作正确的是（）A.将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴B.将橡皮塞下部切出凹穴C.插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面D.将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片9.样品的加入和洗脱的操作不正确的是（）A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面下面B.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D.用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面10.下列说法不正确的是（）A.血红蛋白在释放时，加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，充分搅拌B.血红蛋白溶液离心后分为4层，第1层为白色薄层固体C.血红蛋白溶液离心后分为4层，第4层为暗红色沉淀物D.血红蛋白溶液离心后分为4层，第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液二、多选题11．下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是（）A．采集血样后要高速短时问离心