生物化学课件-第一章-蛋白质资料

生物化学课件-第一章-蛋白质一、什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由多个氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。二、蛋白质的生物学重要性1.蛋白质是生物体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储5）运动与支持作用6）参与细胞间信息传递2.蛋白质具有重要的生物学功能3.氧化供能蛋白质的分子组成

TheMolecularComponentofProtein第一节组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白质含有少量磷、硒或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%蛋白质的元素组成测氮的方法：凯氏定氮法分别约为:C：50%；H：7%；O：23%；N：16%S：0–3%；

其它：微量一、氨基酸

——组成蛋白质的基本单位存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸（甘氨酸除外）。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R氨基酸的旋光异构非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸（一）氨基酸的分类甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00缬氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucineLeuL

5.98

异亮氨酸

isoleucineIleI

6.02脯氨酸

prolineProP

6.30非极性疏水氨基酸丝氨酸

serineSerS

5.68

半胱氨酸

cysteineCysC

5.07

蛋氨酸

methionine

MetM

5.74天冬酰胺

asparagineAsnN

5.41

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

5.65

苏氨酸

threonineThrT5.602.极性中性氨基酸色氨酸

tryptophanTryW

5.89酪氨酸

tyrosineTryY

5.663.芳香族氨基酸

苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22赖氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginineArgR

10.76组氨酸

histidineHisH

7.594.酸性氨基酸5.碱性氨基酸几种特殊氨基酸

脯氨酸（亚氨基酸）

半胱氨酸

+胱氨酸二硫键-HH人体必需氨基酸有八种：

MetTrpLysValIleLeuPheThr

“假设来借一两本书”1.紫外吸收色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm

附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。（二）氨基酸的理化性质2.茚三酮反应氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性离子

阳离子阴离子3.两性解离及等电点等电点(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。pI

=½·(pK1+pK2)二、肽*肽键(peptidebond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。（一）肽(peptide)+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键肽键有部分双键性质肽键由于共振而具有部分双键性质，因此，肽键比一般C-N键短，且不能自由旋转肽键原子及相邻的a碳原子组成肽平面相邻的a碳原子呈反式构型肽键比一般C-N键短肽键为一平面相邻的a碳原子呈反式构型肽键（酰胺键）肽的命名与方向

丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸N→C残基*肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……*

肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有两端*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。N末端C末端牛核糖核酸酶（二）生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH还原酶NADPH+H+NADP+生理作用：①作为体内重要的还原剂；保护蛋白质或酶免遭氧化，使它们处在活性状态；②可还原细胞内产生的H2O2，避免细胞受损；③其巯基具有嗜核特性，能与外源的致癌剂或药物等结合，从而阻断它们与DNA、RNA或蛋白质结合，保护机体免遭损害；④参与氨基酸的吸收过程

体内许多激素属寡肽或多肽

神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽蛋白质的分子结构

TheMolecularStructureofProtein

第二节蛋白质的分子结构包括一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)高级结构定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。一、蛋白质的一级结构主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。

一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。二、蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象

。定义

维系二级结构主要的化学键：

氢键

（一）肽单元参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元

(peptideunit)

。Ca

原子为肽平面间的连接点↗↗↗↗↗

蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋(-helix)

-折叠(-pleatedsheet)

-转角(-turn)

无规卷曲(randomcoil)

（二）-螺旋0.54nm侧视图俯视图脯氨酸（三）-折叠

平行

反平行（四）-转角和无规卷曲-转角用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。

无规卷曲

——泛指那些不能归入明确的二级结构的多肽区段（五）模体在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。钙结合蛋白中结合钙离子的模体

锌指结构（六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或β-折叠，它就会出现相应的二级结构。三、蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和VanderWaals力等。主要的化学键整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。（一）定义特点：次级键

肌红蛋白(Mb)N端C端（二）结构域大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)。结构域是在较大的蛋白质分子中所形成的两个或多个在空间上可明显区别的局部区域。特点：1.结构域具有独特的空间构象；2.与分子整体以共价键相连，并承担特定的生物学功能。3-磷酸甘油醛脱氢酶纤连蛋白分子的结构域（三）分子伴侣(chaperon)协助新生肽链正确折叠的一类蛋白质，通常不参与靶蛋白的生理功能。分子伴侣通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。主要有三大类：热休克蛋白(heatshockprotein)伴侣蛋白(chaperonin)核质蛋白(nucleoplasmin)亚基之间的结合力主要是氢键、离子键和疏水作用。四、蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基

(subunit)。血红蛋白的四级结构

从一级结构到四级结构血红蛋白蛋白质的一级结构是它的氨基酸序列蛋白质的二级结构是由氢键导致的肽链卷曲与折叠Primary

structureSecondary

structure蛋白质的三级结构是多肽链自然形成的三维结构蛋白质的四级结构是亚基的空间排列Polypeptide

(singlesubunit

oftransthyretin)Transthyretin,withfour

identicalpolypeptidesubunitsTertiary

structureQuaternary

structure蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三节（一）一级结构是空间构象的基础一、蛋白质一级结构与功能的关系牛核糖核酸酶的一级结构二硫键

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性（二）一级结构提供进化信息

细胞色素C的进化树（三）一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构二、蛋白质空间结构与功能的关系Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。（二）血红蛋白的构象变化与结合氧肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线*协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positivecooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应

(negativecooperativity)O2血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。变构效应(allostericeffect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。（三）蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨廷顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病第四节蛋白质的理化性质与分离纯化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein蛋白质分类按化学组成分类单纯蛋白；结合蛋白按分子形状分类纤维状蛋白；球状蛋白

-structure

Thestructureofhairandhair-keratin纤维状蛋白质（一）蛋白质的两性电离一、理化性质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。（二）蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性丧失。

造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。

变性的本质——

破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。

应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

（四）蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。（五）蛋白质的呈色反应⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)

蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。⒉双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，在540nm波长处有最大吸收峰。此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质的含量。蛋白质的分离提纯技术一、蛋白质分离提纯的基本思路二、分离纯化技术的基本原理三、纯度鉴定

一.基本思路

目标蛋白/有效成分检测方法的建立-选材-前处理/抽提-粗分级-精/细分级-鉴定/(结晶)-保存低温、操作力度的把握检测方法的建立：

含量测定：活性测定：差异入手：以最少的步骤完成纯化粗分级：大量差异大的杂质的去除精细分级：性质差异小的杂质的去除

粗分级-精/细分级：一、沉淀法丙酮沉淀盐析等电点沉淀免疫沉淀二、透析及超滤透析(dialysis)

：利用透析袋将大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。超滤:利用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留量的超滤膜，达到浓缩蛋白质的目的。三、电泳（electrophoresis）利用蛋白质何种性质?四、层析(chromatography)利用蛋白质何种性质?层析（色谱）技术GelFiltrationIonExchangeHydrophobicInteractionAffinity

ReversedPhase凝胶过滤离子交换疏水作用亲和反