细胞内蛋白质降解(高级生化课件)

细胞内蛋白质降解生命学院

张林生Chapter5

1．概述

早在1940年代，H.Borsook和R.Schoenheimer用同位素标记试验证明了活细胞组分不断进行更新。细胞不断地用氨基酸合成蛋白质，又把蛋白质降解成氨基酸，这种貌似浪费的过程实际上为细胞提供了防止反常蛋白积累以及控制酶和调节蛋白总量的重要手段。每一种蛋白质在细胞内的数量一方面取决于它的合成，包括基因转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平的调控；另一方面则取决于它的降解。尽管直到1970代末才真正揭示了细胞内蛋白质选择性降解的分子机制，无论如何，降解是维护细胞内蛋白质水平不可或缺的控制步骤。

无论何时对细胞内特定蛋白质的动态进行观察，就会发现它像放射性同位素一样服从一级反应动力学。因此通常用半寿期表示其降解速率，即一种蛋白质合成之后被降解一半所用的时间。细胞内蛋白质的半寿期并不相同，如表5.1所示，大鼠肝细胞酶类的半寿期多在鸟氨酸脱羧酶的11分钟到乳酸脱氢酶的19天的范围内。即使在同一细胞器内，蛋白质的降解速率也不相同，如心肌线粒体中δ-氨基-γ酮戊酸合酶和鸟氨酸转氨甲酰酶比细胞色素的降解要快得多。这些现象暗示，蛋白质的半寿期取决于它特有的结构和细胞内环境。

蛋白质半寿期（h）短寿命蛋白质：鸟氨酸脱羧酶0.2

δ-氨基γ--酮戊酸合酶1.1

RNA聚合酶Ⅰ1.3

酪氨酸氨基转移酶2.0

色氨酸加氧酶2.5

脱氧胸苷激酶2.6

β-羟基-β-甲基戊二酰辅酶A还原酶3.0

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶5.0长寿命蛋白质：精氨酸酶96

醛缩酶118

细胞色素b5122

甘油醛3-磷酸脱氢酶130

细胞色素b130

乳酸脱氢酶（同工酶5）144

细胞色素c150

透明质酸酶240表5.1大鼠肝细胞一些蛋白质的半寿期当然，特定蛋白的降解速率以及细胞或组织中蛋白质降解的总速率在不同生理条件下是可变的，如应答激素刺激或饥饿。另外，底物、产物、辅因子甚至药物也能影响一种蛋白质在细胞内的降解速率，例如色氨酸加氧酶在其底物色氨酸和辅因子血红素存在时降解较慢；谷酰胺合酶在其终产物谷酰胺浓度增大时加速降解。这种效应的分子机制尚不明了，但在生理上的合理性显而易见，它保证在底物大量存在时酶保持较高浓度，或者当产物过多时酶的水平适当降低。1.1蛋白酶为了尽快把蛋白质降解成氨基酸，细胞在进化中形成了许多裂解肽键的酶，即所谓肽酶（peptidase）。肽酶按其作用特点可分为肽链外切酶（exopeptidase）和肽链内切酶（endopeptidase）。前者包括氨肽酶（aminopeptidase）和羧肽酶（carbaxypeptidase），分别从肽链的N-端和C-端裂解肽键，每次切下一个氨基酸。肽链内切酶即蛋白酶，作用于肽链内部的肽键。细胞内蛋白酶种类繁多，分子大小和结构、作用机制和调节机制以及亚细胞定位等差异甚大，前人按其活性中心必需基团将蛋白酶划分为以下四类：羧肽酶及其活性中心的结构

（1）丝氨酸蛋白酶（EC3.4.21）：

其活性中心都有一个，Asp-His-Ser电荷中继网，通过共价催化裂解特定的肽键，都受二异丙基氟磷酸（DIFP）的抑制。丝氨酸蛋白酶包括胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）家族和枯草溶菌素（subtilysin）家族，真核细胞的丝氨酸蛋白酶均属前者，其中有许多是分泌型蛋白酶，如胰蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、血浆激肽释放酶、脯氨酰基肽链内切酶、精子头粒蛋白酶、组织蛋白酶G和R等。1.1.1.蛋白酶的分类胰凝乳蛋白酶枯草溶菌素丝氨酸蛋白酶及其活性中心的结构胰蛋白酶-胰腺胰蛋白酶抑制剂复合物游离的胰蛋白酶抑制剂

（2）半胱氨酸蛋白酶（EC3.4.22）

其活性中心都有Cys和His，通过共价催化裂解特定的肽键，受低浓度对-羟基汞苯甲酸（pHMB）和碘乙酸等烷基化试剂的抑制。按进化渊源可划分成三个家族：链球菌溶血素（streptolysin）家族；梭菌蛋白酶（clostripain）家族和木瓜蛋白酶（papain）家族，真核细胞半胱氨酸蛋白酶都属于后者，主要存在于细胞溶胶和溶酶体（液泡）内，如组织蛋白酶B、L和H、N、S、M、T、依赖金属的半胱氨酸蛋白酶等。

钙依蛋白calpain(calcium-dependentpapain-likeproteinase)是一种Ca2+激活的中性蛋白酶，由80kDa的大亚基和30kDa的小亚基组成，在细胞溶胶中降解细胞骨架、受体等长寿命蛋白和一些蛋白激酶。

木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶及其活性中心的结构

（3）天冬氨酸蛋白酶（EC3.4.23）

活性中心有两个必要的Asp，主要通过广义酸碱催化裂解特定的肽键，受抑胃肽（pepstatin）专一抑制。天冬氨酸蛋白酶仅存在于真核细胞，分子量约30~40kDa，如胃蛋白酶、凝乳酶、肾素、组织蛋酶D和E等。

胃蛋白酶天冬氨酸蛋白酶及其活性中心的结构天冬氨酸蛋白酶（4）金属蛋白酶（EC3.4.24）活性部位有必要的二价金属离子，绝大多数情况下是Zn2+，有时为Ca2+，分子量17~800kDa，受金属螯合剂如EDTA等的抑制。金属蛋白酶中深入研究过嗜热菌蛋白酶，其中的Zn2+直接参与肽键断裂，Ca2+大概主要稳定酶分子的构象。属于金属蛋白酶的还有ER、线粒体和叶绿体的信号肽酶、成纤维细胞胶原酶、白明胶酶、脑啡肽酶、原胶原C-蛋白酶、meprin等。还发现一些重要的蛋白酶不属于以上四类，如后面要讨论的蛋白酶体、胱天冬蛋白酶等。嗜热菌蛋白酶金属蛋白酶及其活性中心的结构ADAMTS,血管性血友病因子裂解蛋白酶,是一种金属蛋白酶。Signalpeptide信号肽Pro-domainMetalloproteinasedomain金属蛋白酶结构域Disintegrindomain解离素结构域Thrombospondintype血小板型Cysteine-richdomain富含半胱氨酸域Spacerregion间隔区Mucin-linkedomain联域粘蛋白ProteaseandlacuninmePon-i-likemotifCubilinmotif

1.1.2蛋白酶复合物

（2）E.coliClpAP蛋白酶

（3）E.coliHslVU蛋白酶

（4）E.coliFtsH蛋白酶FtsH蛋白酶是位于膜上的依赖ATP的金属蛋白酶参与细胞内膜蛋白和细胞质蛋白的各种降解过程。

（5）ThermoplasmaacidophilumTricorn蛋白酶Tricorn蛋白酶是一种超分子体系的蛋白水解酶，主要表现寡肽酶活性，现已基本弄清其组成、结构以及在蛋白质降解途径中的功能。从古细菌、原核细胞到真核生物，都有多个亚基组成的、自我区隔化的（self-compartmentalization）蛋白酶复合物：

(1)E.coli

Lon

蛋白酶,Lon蛋白酶是一种在各种生物体内广泛分布并且具有多种生物功能的蛋白质。科学发现，Lon蛋白酶在人体内负责把损坏的蛋白质分解并清除掉，是一种天然抗氧化剂，该发现有助于制定合理的饮食结构，开发延缓衰老过程的新药。

ClpPE.coliHslVU蛋白酶FtsH蛋白酶FtsH蛋白酶由分子量70-80kDa的同型或异型亚基组成六聚复合体蛋白水解活性位点埋在六聚复合体孔穴的中央。结构分析表明原核生物和真核生物中的Fts蛋白酶都具有共同的保守模块Motif。在FtsH蛋白酶的N端有两个跨膜域将其锚定在细胞质膜上。其中第二个跨膜域高度保守可以影响蛋白酶的水解活性和蛋白的寡聚化。在跨膜域的C端紧邻一个约2个氨基酸的保守区域称为AAA结构域。AAA结构域的ATP酶活性和分子伴侣活性对于FtsH蛋白水解活性的发挥十分重要。FtsH蛋白酶的C端有一个锌离子结合模块Zincbindingmoti与Zn2的结合也是tsH蛋白酶催化活性所必需的。FtsH蛋白酶TricornProteinase1.2蛋白质降解的生物学意义

最近十几年对各类生物细胞内蛋白降解的研究取得了长足的进展。以植物细胞为例，每个区隔有一个或多个降解途径（图5.1）。图5.1植物细胞中蛋白酶和蛋白水解途径的亚细胞定位图示一个典型的植物细胞内和亚细胞房室已鉴定的蛋白酶。“？”表示原核蛋白酶或尚待确认。Chloro

：叶绿体；ER：内质网，Mito：线粒体

体外系统研究表明，哺乳动物细胞质至少有两类重要的蛋白水解系统:溶酶体系统或酸性系统，主要负责降解外来蛋白、膜蛋白和长寿命蛋白；泛肽-蛋白酶体系统或碱性系统，主要降解反常蛋白和短寿命蛋白。与消化道内食物蛋白的消化不同，细胞内蛋白质降解是高度受控制的复杂过程。细胞内蛋白质降解的一般特性：

（1）大多数蛋白质降解需要能量，由于肽键水解是放能的，大多数纯化的蛋白酶也与能量无关，因此细胞内蛋白降解包括依赖能量的步骤，而且具有调控作用。

（2）快速。很难探测到细胞内蛋白降解的中间产物，这表明蛋白水解装置一旦遇到合适目标，立即将其彻底消化，避免降解中间产物的累积干扰正常的生理活动。

（3）蛋白酶的专一性较低，为了避免对细胞蛋白质造成随机破坏，必须对它们进行严格的调控和区域化。（4）细胞内蛋白水解是高度选择性的。即使在同一细胞环境，不同蛋白质的半寿期从数分钟到数周，决定其半寿期的信号常常是小的、保守的结构模体。该过程不仅是复杂的基因功能调控级联的最后步骤，而且是氨基酸再循环系统的组成部分。细胞发育阶段的转移和对新环境条件的适应能力经常要求迅速拆除现存的调控网络，这常常依赖于水解有关的蛋白质。蛋白质水解在决定活性蛋白质最终浓度方面的优势在于它的快速和不可逆性。

细胞内蛋白质降解的生物学意义可概括为以下几个方面：1.2.1维持细胞内氨基酸代谢库的动态平衡

维持细胞家政和生长发育需要保证氨基酸代谢库的动态平衡，以正常成年男子（体重70kg）为例，体内的氨基酸代谢库需要保持在600~700g，每日从食物中吸收70~100g，从组织蛋白降解中回收300~500g，新合成的30~40g，合成组织蛋白需消耗300~500g，分解代谢消耗120~130g，还有少量用于合成其它含氮物质。1.2.2参与细胞程序性死亡和贮藏蛋白的动员

生长发育伴随有细胞死亡，有时大批发生，甚至整个组织器官，有时仅局限于少数或个别细胞。这是个有特定目标、特定时间、由内外信号启动的极其复杂的过程。在此期间细胞内蛋白质经专一的水解途径转变成氨基酸，转运至其它组织用于生长或贮藏。例如叶片和花衰老时70%以上的蛋白质被水解回收。木质部和厚壁组织的分化、花粉开裂前绒垫层的分解以及种皮、周皮的成熟，都涉及部分细胞有计划的死亡。此外，种子萌发时贮藏蛋白的动员等过程，均涉及蛋白降解途径。1.2.3按化学计量累积寡聚蛋白的亚基或脱辅基蛋白/辅因子比率

例如在Rubisco（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶Ribulosebisphosphatecarboxylaseoxygenase.是光合作用C3碳反应中重要的羧化酶,也是光呼吸中不可缺少的加氧酶.

）组装中，过剩的小亚基被迅速降解（t1/2=2~10min）。在缺叶绿素和Cu2+时，叶绿素a/b结合蛋白和质蓝素也迅速降解。1.2.4蛋白质前体分子的水解裂解加工

许多蛋白质是以前体分子形式合成的，须经有限的水解，切去多余的残基或片段，才能生成成熟的蛋白分子。如酶原激活，凝血酶原和纤维蛋白原的激活，信号肽的切除，抗原呈递和转录因子NF-κB的激活等。1.2.5清除反常蛋白质以免其累积到对细胞有害的水平

基因突变、生物合成误差、自发变性、自由基损伤、环境扰乱、病理状态等均可能产生反常蛋白，其中有些可在分子伴侣帮助下再折叠成天然状态，其余的必须经蛋白降解途径加以清除。例如过度曝光加速D1蛋白的光氧化，随之被有选择地降解，再用新合成的D1补充，才能恢复光合电子传递。又如血红蛋白是半寿期最长的蛋白质之一，红细胞在人体可持续存活110天，在此期间Hb都是稳定的。然而，参入Val类似物氨基氯甲酸的珠蛋白半寿期只有10~12min，比正常Hb的降解快了1000多倍。同样，高铁血红蛋白或β-地中海贫血症患者产生的过多的α亚基，都会被细胞内蛋白降解系统识别和清除。1.2.6控制细胞内关键蛋白的浓度，调节代谢或控制发育进程

例如植物利用硝态氮的第一个酶硝酸还原酶、催化乙烯合成的限速酶ACC合酶（1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶）

、叶绿素合成中的关键酶NADPH：原叶绿素酸酯氧化还原酶、精胺合成中的限速酶鸟氨酸脱羧酶、萜类合成中的限速酶HMG-CoA还原酶（3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A）等，许多转录调控蛋白、原癌基因产物和癌压制蛋白以及信号转导系统的组分都是短寿命蛋白，它们起作用之后随即通过降解途径被迅速清除。在内外信号的作用下对它们的基因表达水平进行精密的调节，就能严格控制这些蛋白的细胞内浓度，从而调节有关代谢或控制发育进程。特别是细胞周期的运转，实质上是一系列调节蛋白在特定时间出现、活化并发挥效能，驱使细胞周期沿时相有序运转。细胞通过①修饰一些蛋白质（磷酸化/去磷酸化）；②合成新蛋白（如cyclins,细胞周期蛋白，是特定时相短暂出现的基因表达产物，是细胞周期素依赖性激酶(CDK)的基本激活亚基，对细胞通过细胞周期调控点的调节上起关键性作用。目前已发现Cyclins有19个成员。细胞周期的紊乱将导致无限制的细胞分化，这是肿瘤发生

）；③水解多余蛋白（如按细胞周期降解多余的cyclins），实现对细胞周期运转的控制。在细胞周期调控中M期促进因子

MPF（Mphasepromotingfactor）占有特殊地位，由两个亚基组成，一种是细胞周期蛋白，为调节蛋白，在间期开始合成，在G2/M达到高峰，含有毁灭盒，在M期结束时经循环体（

cyclosome）泛肽化后，被26S蛋白酶体迅速降解，造成MPF钝化，细胞退出M期。与此同时，G1期cyclin开始合成，累积，达到一定浓度后即与p34cdc2

(细胞周期蛋白依赖性激酶)

，结合，激活其激酶活性，通过磷酸化作用活化一系列转录因子，启动与DNA复制相关的基因群，促使细胞进入S期。此刻，磷蛋白-泛肽连接酶复合物活化，催化Gl期cyclin泛肽化，然后被26S蛋白酶体降解，p34cdc2再次失活。p34cdc2一个是依赖周期蛋白起作用的蛋白激酶，其中周期蛋白为调节亚基。能够促使染色体凝集，使细胞由G2期进入M期的因子。后者是一种Ser/Thr蛋白激酶，在细胞周期内浓度不变；同时，M期细胞周期蛋白（cyclin）开始合成，累积，与p34cdc2（细胞周期蛋白激酶）结合。DNA复制终结，细胞进入G2期，在有丝分裂原诱导下，cdc25基因表达，其产物是一种蛋白磷酸酶，可水解p34cdc2Thr-14和Tyr-15上的磷酸基，从而激活MPF。在MPF作用下，核纤层蛋白被磷酸化，核膜解体并重现；组蛋白Hl被磷酸化，染色体凝聚；微管蛋白被磷酸化，细胞骨架重新排列组合，使细胞进入M期。同时cyclosome活化，开始使M期cyclin泛肽化和降解。细胞周期蛋白B细胞周期依赖性激酶Weel蛋白激酶是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员,其主要通过抑制Cdc2的活性对细胞周期进行调控,进而抑制细胞进行有丝分裂.本文将对Weel蛋白酶的作用机制、1.2.7参与细胞防御机制

例如补体系统是脊椎动物血液中的一组不稳定的球蛋白，至少包括11种组分，其中许多具有蛋白酶活性。抗体-抗原结合后发生构象改变，即可与补体组分结合，触发补体激活的级联反应，形成攻膜复合物将细胞性抗原溶解，同时还可吸引吞噬细胞将病原体吞噬，然后在溶酶体内将其消化。血液中的凝血系统至少包括7种蛋白酶原，在凝血信号刺激下依次激活，将纤维蛋白原裂解成纤维蛋白，形成稳定的交联纤维蛋白。溶解血栓的纤维蛋白溶解系统实际上也是蛋白酶。

1.3.9参与胁迫应答信号传递1.3.8蛋白质降解机制研究用于生物技术例如Lon－E．co1i中La缺失，可避免将引入的外源基因编码的蛋白质降解。胁迫信号通过质膜蛋白酶促降解传递调节基因表达2．细胞内蛋白质降解途径溶酶体途径:—无选择地降解蛋白质泛肽途径

—给选择降解的蛋白质加以标记真核生物细胞内蛋白质降解的两种降解系统2.1溶酶体体系自噬体通过与溶酶体融合而形成成熟的自噬体即自噬溶酶体(Autolysosomes)。在自噬溶酶体内,自噬体内层膜以及内容物在溶酶体内被降解。然后,溶酶体通透酶释放出降解产物到细胞质中以供生物合成和代谢,这些降解产物包括氨基酸、脂类、核苷酸和碳水化合物等。

溶酶体是由一个单位膜围成的球状体。溶酶体内富含水解酶。由于溶酶体外面有膜包着,使其中的消化酶被封闭起来,不致损害细胞的其他部分.否则膜一旦破裂,将导致细胞自溶而死亡.

溶酶体第一方面的功能是参与细胞内的正常消化作用。大分子物质经内吞作用进入细胞后，通过溶酶体消化，分解为小分子物质扩散到细胞质中，对细胞起营养作用。第二个方面的作用是自体吞噬作用。溶酶体可以消化细胞内衰老的细胞器，其降解的产物重新被细胞利用。

第三个作用是自溶作用。在一定条件下，溶酶体膜破裂，其内的水解酶释放到细胞质中，从而使整个细胞被酶水解、消化，甚至死亡，发生细胞自溶。细胞自溶在个体正常发生过程中有重要作用。如无尾两栖类尾巴的消失等。溶酶体系统现已查明，溶酶体中至少有60多种水解酶，包括多种组织蛋白酶（见表5.2）。其中包括半胱氨酸蛋白酶（组织蛋白酶B、L、H、M、N、S和T）和天冬氨酸蛋白酶（组织蛋白酶D和E）。组织蛋白酶多为单体，分子量20~40kDa，均为糖蛋白，在酸性pH下活性最大，在碱性pH下不稳定。组织蛋白酶B优先作用于Arg后的肽键，曾被称为类胰蛋白酶；组织蛋白酶L对与两个疏水残基相邻的残基之后的肽键有很强的活性；组织蛋白酶D优先裂解疏水残基近旁的肽键。在体外系统组织蛋白酶H表现出氨肽酶活性，组织蛋白酶B的同工酶表现出肽基二肽酶活性，从C-端切下二肽。酶分子量（kDa）近似酶最适pH常用的分析底物a抑制剂组织蛋白酶B（EC3.4.22.1）255Z-Arg-Arg-NMec巯基试剂组织蛋白酶L（EC3.4.22.15）245偶氮酪蛋白巯基试剂组织蛋白酶H（EC3.4.22.16）285Arg-NMecZ-Phe-Phe-CHN2组织蛋白酶M305~7醛缩酶巯基试剂组织蛋白酶N203.5胶原巯基试剂组织蛋白酶S253.5血红蛋白巯基试剂组织蛋白酶T356TAT，偶氮酪蛋白巯基试剂组织蛋白酶D（EC3.4.23.5）423.5血红蛋白抑胃肽组织蛋白酶E1002.5白蛋白抑胃肽a.缩写：NMec,N-甲基香豆素；TAT，酪氨酸转氨酶；Z-Phe-Phe-CHN2,苯甲基氧羰基-Phe-Phe-重氮甲基酮表5.2溶酶体中的一些蛋白酶

大量证据显示，饥饿胁迫期间大鼠肝细胞中的溶酶体特别大，含有细胞质或细胞器碎片，这种“自体吞噬泡”的数目与蛋白质降解的速率密切相关。用氯奎（chloroguine）处理细胞，这种弱碱可扩散到溶酶体内并在其中蓄积，使pH升高，组织蛋白酶活性下降，蛋白质降解总速率也随之下降。如用组织蛋白酶B和L的抑剂leupeptin（亮抑酶肽）处理细胞，细胞蛋白分解的总速率也明显下降。

从而表明溶酶体系统在某些生理条件下似乎是细胞蛋白降解的主要途径，它在蛋白质水解总量所占份额取决于营养和内分泌状况。在氨基酸供给不足的条件下，自体吞噬泡的数量增加，细胞蛋白降解加速，以弥补氨基酸代谢库的亏缺。许多激素可以调节溶酶体的蛋白降解速率，如胰岛素可通过减少自体吞噬泡的形成抑制肝和骨骼肌溶酶体系统降解蛋白；而甲状腺素却加速肌肉溶酶体酶的合成和蛋白质降解速率。在许多病理条件下溶酶体系统主要负责降解糖蛋白、蛋白聚糖、脂蛋白、膜蛋白、外来蛋白等，但至今没有足够的证据表明它的作用是高度选择性的。自噬过程及其分子机制

目前,在酵母和其他真核生物中鉴定了许多参与自噬的基因,这些基因被命名为自噬相关基因(Auto-phagy-relatedgenes,ATG)。一系列由atg基因的产物组成的复合物参与协调自噬体(Autophagosomes)的形成(见下图)。真核生物细胞内自噬的过程动物细胞溶酶体系统示意图

溶酶体的发生过程

溶酶体的功能

1、清除无用的生物大分子、衰老的细胞器及衰老损伤和死亡的细胞；2、防御功能（病原体感染刺激单核细胞分化成巨噬细胞而吞噬、消化）；3、其他重要的生理功能4、溶酶体与疾病

其它重要的生理功能作为细胞内的消化“器官”为细胞提供营养；分泌腺细胞中，溶酶体摄入分泌颗粒可能参与分泌过程的调节参与清除赘生组织或退行性变化的细胞；受精过程中的精子的顶体反应。溶酶体与疾病溶酶体酶缺失或溶酶体酶的代谢环节故障，影响细胞代谢，引起疾病。如台-萨氏（Tay-Sachs）等各种储积症（隐性的遗传病）某些病原体（麻疯杆菌、利什曼原虫或病毒）被细胞摄入，进入吞噬泡但并未被杀死而繁殖（抑制吞噬泡的酸化或利用胞内体中的酸性环境）类风湿性关节炎

溶酶体膜很易脆裂，其释放的酶导致关节组织损伤和发炎。

矽肺二氧化硅尘粒（矽尘）吸入肺泡后被巨噬细内吞噬，含有矽尘的吞噬小体与溶酶体合并成为次级溶酶体。二氧化硅的羟基与溶酶体膜的磷脂或蛋白形成氢键，导致吞噬细胞溶酶体崩解，细胞本身也被破坏，矽尘释出，后又被其他巨噬细内吞噬，如此反复进行。受损或已破坏的巨噬细胞释放“致纤维化因子”，并激活成纤维细胞，导致胶原纤维沉积，肺组织纤维化。2.2蛋白质降解的泛肽途径10.21已经知道生命体对外源蛋白质的消化，利用过程是由特定的蛋白酶如胰蛋白酶来完成，这些酶可以将食物中的蛋白质分解为氨基酸以供机体利用。细胞内存在着溶酶体可以分解蛋白质，这个过程不需要能量，而在20世纪50年代科学家发现，细胞内也可以分解自身产生的蛋白质，但这个过程需要能量(主要以ATP的形式)。细胞消化外源蛋白不需要能量，而降解自身蛋白质则需要能量，科学家对这种现象迷惑不解!推测这两个应该是不同的生理过程，因此科学家开始研究细胞降解自身蛋白的生理过程。1977年格德伯格和同事从未成熟红细胞(网状细胞)中得到无细胞提取物，并且发现这个提取物可以催化异常蛋白质降解，并且依赖ATP。此发现大大促进了蛋白质降解研究的进程。

2004年10月16日度诺贝尔化学奖授予以色列科学家阿龙·切哈诺沃(AaronCiechanover,1947-)、阿夫拉姆·赫什科(AvramHershko,1937-)和美国科学家欧文·罗斯(IrwinRose,1926-),以表彰他们在80年代发现的泛素调节的蛋白质降解研究领域中的卓越成就。

泛素介导的蛋白质降解的发现1977年，赫什科开始用网状细胞提取物来研究蛋白质的降解，提取物本身含有大量的血红蛋白，从而给研究带来了困难。因此切哈诺沃和赫什科决定使用色谱的方法除去血红蛋白，在除去血红蛋白的过程中，两位科学家发现提取物被分成了两部分，单独时都没有蛋白质降解活性。而只有将两部分混合才能启动ATP依赖的蛋白质降解过程。1978年他们报道启动蛋白质降解的活性成分，这是一种对热比较稳定、分子量仅9000的小肽。将其命名为部分1的活性组分APF-1（activeprincipleinfraction1），后来证实APF-1就是以前发现的泛素。泛素是在1975年从小牛的胰脏中分离得到的1个含有76个氨基酸的小肽。随后被发现存在于大量不同的组织和有机体(但至今未在细菌中发现)中。因此，命名为泛素(ubiquitin）来自于拉丁文（ubique）意思为“处处”，以说明其广泛存在。开始认为泛素参与了白细胞的成熟，而蛋白质的降解研究赋予了它更多的功能。1980年，切哈诺沃（AaronCiechanover,1947-)和赫什(AvramHershko,1937-)科研究小组和罗斯研究小组分别报道了自己的研究结果，他们发现APF-1(即泛素)可以以共价键与蛋白质结合。而且一种蛋白质可以和多个APF-1分子结合。后来将这种现象称为多泛素化(polyubiquitination)。蛋白质的多泛素化是启动蛋白质降解的信号。

泛素仅仅给需要降解的蛋白质贴上一个“标签”，而蛋白质的降解则需要蛋白酶体来完成。

真核细胞中，细胞溶胶和细胞核内多数蛋白由泛肽-26S蛋白酶体途径降解。泛肽是一种高度保守的小蛋白，在一系列酶的作用下与靶蛋白共价连接。多泛肽化的靶蛋白可被26S蛋白酶体识别并迅速降解。泛肽途径的酶促过程概括如图5.2。26S蛋白酶体降解泛素化蛋白底物的示意图2.2.1泛肽（ubiquitin）

泛肽是迄今发现的最保守的蛋白质，是依赖ATP的蛋白水解系统，一种热稳定因子，含76个氨基酸，因其广泛存在于各类真核细胞。图5.4为高等植物的泛肽，与衣藻、酵母、哺乳动物的泛肽相比，分别有1、2、3个氨基酸取代。所有泛肽均有相同的三维结构：N-端部分形成坚实的小球，Lys-48、Lys-29和Lys-63均在表面；C-端以Gly-Gly结尾形成一个凸出。泛肽主要定位于细胞溶胶和细胞核，在膜和溶酶体中仅有极少量。图5.4根据X-射线晶体衍射确定的泛肽三维结构29、48和63位的Lys残基参与多泛肽链的形成泛素调节的理论基础

生物体内存在着两类蛋白质降解过程，一种是不需要能量的，比如发生在消化道中的降解，这一过程只需要蛋白质降解酶参与，可以在小肠内将食物降解为氨基酸；另一种则需要能量，它是一种高效率、指向性很强的降解过程。比如多数细胞内的蛋白质降解需要能量，这是由于在细胞内蛋白质的降解过程中发生了一系列的反应，最终使得将要被降解的蛋白质被一种多肽链所标记，这就意味着细胞对蛋白质降解具有很高的选择性，这种标记势必需要一定的能量，而这种能量在生物体内是以ATP的形式提供的。

依赖泛素的蛋白水解途径以Arabidopsis的AtUBQ1，4和5基因为例，从合成多泛素或泛素嵌合蛋白开始，由α-氨基泛素C-端水解酶将它们加工，释放出泛素单体。再由E1s、E2s、和E3s按顺序通过依赖ATP的反应把泛素单体连接到靶蛋白上。泛素化的蛋白或被依赖ATP的26S蛋白酶体降解，同时伴随泛素的释放，或者由ε-氨基水解酶脱素肽化。Ubq:泛素；K：泛素连接位点的Lys

通常只有一种E1，催化泛素的活化。而E2和E3却存在许多种，尤其是E3，主要负责蛋白-素肽连接的选择性或蛋白降解的专一性。26S蛋白酶体由至少30多种不同的亚基组成，包括空桶状的20S蛋白酶体和结合在其两端的19S调节复合物，催化多素肽化靶蛋白质降解（图5.3）。泛素—蛋白酶体途径(upp)

一系列相关的酶1.泛素活化酶(E1)E1催化Ub的C-末端与酶分子中巯基结合，同时消耗1分子ATP。已克隆了酵母（UBA1）、小麦（TaUBA1、2、3）和人的E1基因，显示出很强的保守性。例如人与酵母的E1有53%相同。敲除UBA1基因对酵母是致死性的。一些动物温敏型突变细胞在限制温度下E1部分钝化，导致短寿命蛋白和反常蛋白累积或表现为细胞周期制动。

2.泛素偶连酶(E2或Ubc)

是泛素与蛋白底物结合所需的第二个酶。细胞内有多种泛素偶连酶基因,大多数泛素偶连酶有一个14～16kD的核心,含有活性所必需的半胱氨酸残基。在不同的泛素偶连酶间有约35%的同源性,这一区域可能参与泛素偶连酶和蛋白底物的结合。已鉴定出大批E2，如酵母中有13个E2基因，小麦胚至少有14种E2，拟南芥的14个E2基因已经克隆。不同的E2将与不同的靶蛋白和不同的E3匹配，成为底物蛋白泛素化专一性的基础。在酵母中，Ubc2/Rad6与DNA修复和N-端规则蛋白的降解有关；Ubc5/cdc34参与细胞周期G→S期过渡；Ubc4和Ubc5则涉及许多短寿命蛋白和反常蛋白的降解。3.泛素-蛋白连接酶是泛素与底物蛋白结合所需的第三个酶。泛素-蛋白连接酶在决定泛素介导的底物降解方面有特殊的作用。不同类型的泛素-蛋白连接酶间缺乏序列同源性,而且分子量差异较大去泛素化酶

在泛素途径中靶蛋白被26S蛋白酶体降解，泛素自己只是降解信号，并未被降解，而是经去泛素化酶（deubiquitinatingenzymes,DUBs）再生之后重复利用。DUBs属半胱氨酸蛋白酶，具有裂解酯键、硫酯键以及泛素C-端与Lys侧链ε-NH2形成的异肽键的活力，亦被称为异肽酶。已在不同物种的许多组织中鉴定出多种DUBs，酵母中至少有16个基因编码DUBs。DUBs由两个基因家族编码，一个是泛素C-端水解酶（Ubcarboxyl-terminalhydrolases，又称Ⅰ型UCH），另一个是泛素专一的加工蛋白酶（Ub-specificprocessingproteases，又称Ⅱ型UCH或UBP）。UCHs和UBPs的主要功能是裂解多泛素链内及其与靶蛋白之间的异肽键，保持细胞内游离泛素的浓度，以便对其进行再利用；同时还具有编辑功能，使错误泛素化的蛋白质去泛素化，以免被26S蛋白酶体降解；

有时DUBs还能对不规范的多泛素链进行修剪，使之更好地被26S蛋白酶体识别与结合。DUBs还能裂解泛素Gly76的羧基与α-NH2间的肽键，用于泛素前体的加工。

现已查明，有些DUBs实际上是26S蛋白酶体中19S调节复合物的组分，如兔网织红细胞19S调节复合物中30kDa的C-末端水解酶和果蝇PA700中的37kDa的异肽酶p37a；有些DUBs只短暂地与蛋白酶体结合，如海兔中的Ap-uch、酵母的Doa4和人的UBPY；另一些DUBs则以游离方式存在，降解游离的多泛素链或加工泛素前体，如哺乳动物UCH-L1，2，3以及酵母Yuh1和异肽酶T。

图5.5展示了这些DUBs不同的作用方式。不同类型的UCHs影响发育、基因沉默、长期记忆等重要生理过程，还参与细胞增殖的调节，但详细的分子机制尚待查明。图5.5在泛素缀合物或游离泛素链加工中去泛素化酶不同的专一性左侧为UCHs，右侧为UBPs，从上到下分别为19S调节复合物整合的、暂时结合的和游离的DUBs瞬时界

蛋白酶体(proteasome)

是催化泛素与底物蛋白偶联体降解的关键酶,包括20s蛋白酶体和26s蛋白酶体。

26s是由20s和19s复合体共同结合装配而成,此组装过程需要耗能。

20s蛋白酶体主要分布于细胞质和细胞核，约占细胞总蛋白的1%，蛋白酶体的蛋白水解中心，由14个α型亚基和14个β型亚基组成。Thermoplasmaacidophilum(古菌)只有1种α和1种β亚基，形成同源七元环，再组装成α7β7β7α7园筒状复合物。Rhodococcussp.(红球菌)的NI186/21蛋白酶体由两种α亚基和两种β亚基组成。E.coli的蛋白酶体（Hs1VV复合物）仅有1种β亚基（Hs1）。真核细胞通常有7种不同的α型亚基和7种不同的β型亚基，组装成（α1～α7）（β1～β7）（β1～β7）（α1～α7）园筒状复合物。古老细菌的20S蛋白酶体为直径11.3nm、长14.8nm的园筒，中央形成贯通整个颗粒的孔道，包括3个空腔，中部的大空腔（β7β7）是蛋白水解部位。腔的入口（α7）狭窄，直径仅1.3nm，只允许伸展的肽链进入，同时还能防止水解中间产物逸出（图5.6）。图5.620S和26S蛋白酶体结构示意图20S蛋白酶体结构根据Thermoplasma酶的X-射线晶体衍射数据；19S调节复合物根据大鼠和菠菜中该复合物的电镜照片。C1pAP是叶绿体蛋白酶体，类似于大肠杆菌的Hs1VU复合物，图示的结构根据电镜照片

影响蛋白酶体蛋白水解活性的突变几乎都发生在β亚基上；蛋白酶抑制剂和X-射线分析证明，蛋白酶体的蛋白水解活性由β亚基负责。成熟的β亚基N-端的Thr-1是蛋白酶体的蛋白水解活性位点。类似于丝氨酸蛋白酶的作用机制，这个Thr-1的羟基对底物进行亲核攻击，它的α-氨基则代替组氨酸咪唑基充当质子受体，而活性部位附近的赖氨酸残基还发挥碱催化作用。蛋白酶体中央大腔的两层β型亚基上七聚环各有3个活性位点，但其催化活性有所不同。已发现20S蛋白酶体具有以下3种不同的催化活性：①胰凝乳蛋白酶样活性，作用于大的疏水残基（如Phe、Trp、Tyr等）的羧基形成的肽键；②胰蛋白酶样活性，作用于碱性氨基酸（如Lys、Arg等）的羧基形成的肽键；③胱天蛋白酶样活性，作用于Glu、Asp这两个酸性氨基酸羧基形成的肽键。在这些活性共同作用之下，靶蛋白很快被水解成有5～15个氨基酸残基的肽段；这些肽段释放到蛋白酶体外侧，再由其它肽酶迅速降解成游离氨基酸。图5.7为真核细胞26S蛋白酶体示意图。

19s调节复合体为了对蛋白质降解进行精确调控，使蛋白酶体的作用具有高度选择性，20S蛋白酶体必须在ATP存在下与19S调节复合物缔合成26S蛋白酶体。19S调节复合物又称PA700，由18～20种不同的亚基组成，其中6种具有ATPase活性。酵母的6种有ATPase活性的亚基和另外3种亚基形成靠近20S蛋白酶体的基座亚复合物，其余亚基形成距离较远的盖子亚复合物，二者形成“V”字形柔性结构，结合于20S蛋白酶体的两端（图5.7和5.8）。19S调节复合物的主要功能为：识别并结合多泛素化的靶蛋白，已知S5a/Rpn10亚基的C-端有多泛肽链结合部位；激活20S蛋白酶体的蛋白酶活性；参与底物蛋白的伸展，使之能进入20S蛋白酶体腔内；切除（Ub）n链并将其降解成Ub单体。图5.8根据电镜和图像分析得到的26S蛋白酶体轮廓蛋白酶体核心是28个亚基组成4个七元环垛叠而成的圆筒结构，中央的两个β亚基组成的环含3个蛋白水解活性，两个外侧α环各结合一个19S调节复合物。多泛素化的靶蛋白在ATP存在下与19S调节复合物结合，具有ATPase活性的亚基水解ATP，驱动靶蛋白伸展，通过α环疏水通道进入中央空腔，被裂解成肽段后释放到细胞溶胶中泛素—蛋白酶体途径(upp)介导的蛋白水解过程

由泛素介导的蛋白水解过程,分为2个阶段。第一阶段:多个泛素分子与靶蛋白共价结合。首先,泛素经泛素活化酶E1

活化,泛素上76位的Gly与泛素活化酶上特殊的Cys残基形成一个高能硫酯键,并伴有ATP水解;然后,通过转酯作用,泛素从泛素活化酶转移到泛素结合酶E2

的Cys上,形成泛素结合酶-泛素;最后,在泛素连接酶E3参与下,泛素又从泛素结合酶转移到受体蛋白(靶蛋白)的Lys残基上,形成泛素-靶蛋白,使靶蛋白发生泛素化。多个遍泛素分子重复地附加到靶蛋白上,则形成分枝的多Ub链。泛素共有7个Lys残基,在多聚泛素链结构中,其中一个泛素的C-末端Gly与相邻的泛素之间通过Lys48、Lys63或Lys29连接。目标蛋白质1和3：E1、E2催化的泛素激活反应，消耗ATP；2：E3催化的蛋白质激活反应，消耗ATP；4：依赖于E3的蛋白质泛素化反应；5：不依赖于E3的蛋白质泛素化反应；6：26S蛋白体催化蛋白质水解；7和8：异肽酶催化的水解反应，使泛素游离出来。第二阶段:

靶蛋白在26s蛋白酶体的作用下,由泛素介导的蛋白水解过程。经泛素活化的底物蛋白被展平后,通过两个狭孔,进入26s蛋白酶体的催化中心,蛋白降解在20s蛋白酶体内部发生。进入26s蛋白酶体的底物蛋白质被多次切割,最后形成3～22个氨基酸残基的小肽。整个流程分为以下六个步骤：1、E1类酶激活泛素，该过程需要ATP提供一定能量；2、泛素转移至E2类酶；3、E3类酶具有特异性，可以识别出需破坏的目标蛋白质，与目标蛋白质接近的E2-泛素复合体将泛素转移至目标蛋白质；4、E3类酶释放出被泛素标记的蛋白质；5、被标记的蛋白质分子尾端形成一小段泛素分子链；6、泛素分子链在蛋白酶体的端口被识别并脱离蛋白质，目标蛋白质进入蛋白酶复合体的桶状通道最终降解为缩氨酸并由另一端口释放出去。蛋白质降解的泛肽途径E1-S-E1-SHE2-S-E1-SHE2-SHE2-SHATPAMP+PPiE3多泛肽化蛋白ATP26S蛋白酶体20S蛋白酶体ATP19S调节亚基去折叠水解E1：泛肽激活酶E2：泛肽载体蛋白

E3：泛肽-蛋白质连接酶（ubiquitin）发生错误折叠的蛋白质并不是唯一一个进入ERAD系统的底物，ERAD系统还可以调控甾醇合成途径，它可以在甾醇过多的情况下降解掉甾醇合成途径中的限速酶，以此来控制合成速度。图1蛋白质在内质网内的降解途径。错误折叠的蛋白质在内质网内被降解掉需要以下几个步骤。1），附着在内质网膜上的泛素连接酶与其他辅助因子一起识别出折叠错误的蛋白质。2)、所示的错位阶段，蛋白质经由一目前尚不清楚的通道被转运进入胞质溶胶之中。3）、在内质网的胞质溶胶面，底物蛋白被E3泛素连接酶泛素化修饰。4）、在AAA+ATP酶和Cdc48蛋白的作用下，底物蛋白从膜上被去除掉，进入26S蛋白酶体，被降解处理。.内质网内的泛素化机制在蛋白质刚刚合成时它们会通过一个特异性的N连接聚糖（N-linkedglycanstructure）结构被保护起来，可以免遭降解。随后，那些可能发生错误折叠的蛋白质会被内质网中甘露糖苷酶（mannosidase）生成的一种“聚糖密码（glycancode）”所标记（图1）。然后，锚定在内质网膜上的泛素连接酶会破译该“密码”，需要被降解的蛋白质被转运出内质网，经由泛素化途径被26S蛋白酶体降解掉，该过程也被称为内质网相关的降解途径（ER-associateddegradation，ERAD）。分子伴侣和糖基水解酶47（glycosylhydrolase-47）家族蛋白Mns1andHtm1能发现折叠错误的蛋白质，并使其与内质网膜结合连接酶Doa10、RMA1、HRD相结合。当底物蛋白与内质网胞质溶胶面结合后就会被E3连接酶泛素化修饰。所有的泛素连接酶复合体都含有一个重要的含有指环催化结构域的E3连接酶，一个E2结合酶以及其他一些辅助因子蛋白。AAA+ATP酶Cdc48蛋白能使泛素化修饰的底物蛋白从内质网膜上脱离下来。配体蛋白（adaptorproteins）Rad23andDsk2能促使泛素化修饰的底物蛋白进入26S蛋白酶体被降解，同时，Png1蛋白能借助Rad23蛋白的作用使糖蛋白去糖基化。图中酵母蛋白以紫色表示，哺乳动物蛋白以绿色表示。图2酵母细胞和哺乳动物细胞中的蛋白质降解机制。

泛素-26S蛋白酶体系统除负责细胞溶胶和细胞核内短寿命蛋白和反常蛋白的降解以及Ⅰ类MHC抗原肽的加工外，显然还参与了膜受体、转运体的下调。组蛋白的泛素化与转录调控有关：Calson等将标记的泛素注射到Hela细胞中，发现有42%与蛋白质形成高分子量复合物，促进它们的降解；48%为游离状态；10%与组蛋白H2A共价结合。Ub-H2A对启动子TATAbox的亲和力远大于H2A，而且周转很快，表明它参与转录的负调控。泛素化及泛素样修饰的调节功能

果蝇热激蛋白转录因子泛素化之后失活，当受到热冲击时，细胞内游离Ub浓度下降时脱泛素化而活化，Hsp基因表达增强。同时Ub-H2A对转录的阻遏也被解除。泛素基因表达也增强，细胞内游离泛素浓度随着反常蛋白降解而上升，H2A和Hsp转录因子的泛素化也随之增加。蛋白酶体19S调节复合物亚基S5a/Rpn10除识别和结合多泛素链外，还与DNA损伤修复中的核苷酸切除修复因子（如人的hHR23和酵母的Rad23）相互作用。有报道认为19S调节复合物具有核苷酸切除修复活性。19S调节复合另一亚基Rpn4与芽殖酵母一些基因上游的蛋白酶体相关调控元件（PACE）相结合，其中包括与核苷酸切除修复相关的基因。紫外线可引起转录因子Gen4的靶基因群的活化，这种活化需要19S的另一亚基Rpn11。有证据强烈表明泛素系统在发育和凋亡中发挥重要作用，虽然尚未确定涉及的靶蛋白。泛素系统的机能障碍导致多种病理状态，包括癌变，都表明泛素系统还具有多种尚待查明的生物学功能。疾病 缺陷 天使综合征(Angelmansyndrome,AS) E3连接酶E6-AP突变 传性帕金森氏症(AR-JP) E3连接酶parkin突变 Liddle综合征 UPS底物肾钠离子通道β/γ亚基突变 VHL相关肿瘤 E3连接酶VHL突变结肠癌 UPS底物β-catenin突变 范可尼贫血症 UPS底物FANCD2蛋白突变 宫颈癌 HPV介导的加速p53的泛素化降解 各种恶性肿瘤 E3连接酶HDM2和SKP2的突变UPS底物中许多癌基因和抑癌基因突变 乳腺癌和卵巢癌 E3连接酶BRCA1突变 家族性圆柱瘤 去泛素酶CYLD突变 肥厚性心肌病 UPS底物MYBPC3突变 动脉粥样硬化 UPS活性受到抑制 精神分裂症(SCZ)和双相情感障碍(BPD) UPS发生紊乱 囊性纤维化疾病 CFTR蛋白的过度降解 肌肉萎缩 E3连接酶MURF-1和atrogin-1参与肌肉萎缩的发生 泛素蛋白酶体系统异常导致的人类疾病2.3介导细胞凋亡的胱天蛋白酶

细胞凋亡（apoptosis）是正常机体细胞在受到生理和病理性刺激后出现的一种自发的死亡过程，它受相关基因的调控，因此又称程序性死亡（programmedcelldeath），在多细胞生物的组织分化、器官发育以及维持自身稳定中具有重要意义。细胞凋亡一旦失控或发生紊乱，必将导致疾病、畸形甚至死亡。细胞凋亡并不完全等同于程序性细胞死亡。程序性细胞死亡的范畴大于细胞凋亡。吞噬细胞炎症释放细胞内容物崩解吞噬作用坏死细胞凋亡肿胀的细胞器线粒体染色质絮状团块细胞坏死与凋亡的区别—————————————————————————————————————————————————————————

坏死凋亡性质诱导因素强烈刺激，严重损伤较弱刺激，轻度损伤形态变化DNA降解炎症反应基因调控细胞结构全面溶解、破坏、成群细胞死亡胞膜及细胞器相对完整,形成凋亡小体,个别细胞死亡不规则,电泳不呈梯状分布规则,电泳呈梯状分布溶酶体破裂，局部有炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应有,主动而有序的有控降解病理性细胞死亡生理性或病理性细胞死亡无,被动而无序的随机降解蛋白质合成无有凋亡过程Ⅰ受体cAMPCa2+神经酰胺凋亡相关基因激活信号转导细胞膜细胞核凋亡诱导因素+Dnase激活Caspases激活死亡信号凋亡过程ⅡDNase激活Caspases激活凋亡细胞的清除凋亡执行细胞凋亡的形态学变化

细胞缩小而丧失与周围细胞接触，染色质固缩在核膜附近，细胞骨架崩解，核膜消失，DNA断裂成片段，细胞膜起泡，最终细胞解体成许多由细胞膜包裹的凋亡小体，并被周围健康细胞或吞噬细胞吞噬。细胞坏死最主要形态区别是细胞肿胀、破裂、内容物外流并导致炎症反应。apoptosis凋亡时细胞的形态学改变凋亡过程与调控空泡化固缩出芽边集凋亡小体形态学特征：

凋亡细胞最显著的特征是染色质浓缩、染色体DNA断裂、细胞膜形成泡状突起，胞浆中出现由降解的胞浆和细胞核成分被膜性成分包裹形成的凋亡小体。凋亡细胞膜结构和成分的改变可被吞噬细胞识别，然后被吞噬和降解，不会引起局部炎症反应或周围组织的损伤，因而不同于细胞坏死（necrosis）。

凋亡是一个主动的、依赖信号传递的细胞自杀现象，除发育等生理性信号外，病毒感染、放射线照射、毒物和药物、缺血和缺氧等因素均可诱导细胞凋亡。已鉴定出四类涉及细胞凋亡的引发、进行和调控的主要功能分子：即肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族；接应蛋白（adoptor）；胱天蛋白酶（caspase）和凋亡调控蛋白Bcl-2家族。接应蛋白（adoptor）由霍华修医学中心（HowardHughesMedicalInstitute）研究员JoanA.Steitz及耶鲁大学医学系（YaleUniversitySchoolofMedicine）同仁Imed-EddineGallouzi所主导，发表于2001年11月30日号的科学月刊。可以选择性阻断哺乳动物细胞中的讯息RNA（mRNA），自细胞核送出到细胞质，利用细胞通透性缩氨酸（peptide）将抑制性分子传送到细胞内，有助于研究人员了解不同蛋白的角色。

讯息RNA自细胞核送出到细胞质，主要是透过细胞核膜上的孔洞构造，一般相信另有一接应蛋白（adaptor）连于讯息RNA上；此接应蛋白会同时与讯息RNA及接受器（receptor）结合，随即再与核膜上的孔洞作用，将讯息RNA送出细胞核。已成功选择性阻断某些接应蛋白的作用，其中之一称为HuR(humanantigenR)。的接应蛋白其功能。

HuR是RNA结合蛋白中胚胎致死异常视觉(ELAV)家族的一员，作为RNABPs,能通过结合并且稳定在3’非翻译区(UTR)中富含A,U(AREs).又称为类胚胎致死异常视觉1。由于HuR蛋白参与防止讯息RNA之降解（degradation），HuR可能是利用两项独立的传送途径将讯息RNA送出细胞核，其中之一是透过核传送接受器CRM1（出核转运信号肽蛋白的出核因子-1）；另一项途径则完全与CRM1无关。

HuR具有多重功能，包括在稳定及传送作用方面，重点是具有单一个接应蛋白途径，欲了解讯息RNA的传送方式关键必须找出为什么细胞会需要不同的传送途径？凋亡过程+受体cAMPCa2+神经酰胺凋亡诱导因素死亡信号凋亡相关基因激活DNase激活Caspases激活巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞信号转导基因激活执行凋亡凋亡细胞的清除2.3.1胱天蛋白酶capase家族的结构与分类细胞凋亡的生化改变特点：cysteine-containingaspartate-specificprotease（含半胱氨酸的天门冬氨酸特异水解酶）和凋亡有关的两个酶作用：切割染色质DNADNase特点：Ca2+/Mg2+增强活性，Zn2+抑制其活性Caspases作用：灭活凋亡抑制物水解蛋白质结构，形成凋亡小体水解凋亡相关活性蛋白使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICAD破坏细胞结构，如Lamina将调节区与催化区分离，使蛋白失活，如GelsolinCaspase如何杀死细胞？Caspases家族简介1993年Yuan从哺乳类细胞中发现第1个Ced-3同源分子，叫白细胞介素-1β转换酶（Interleukin-1βConvertingEnzyme，ICE），Pro-ICE含404个氨基酸，分子量45KD。在一定形式下可自身催化产生20KD和10KD二个片段，聚合形成（p20）2(p10)2杂四聚体，为活化的ICE。

到1998年底为止共发现有14个Ced-3同源分子，分别定名为Caspase1-14。

Caspases的分子均具有下列的结构特征：①以无活性的Pro-Caspases形式存在。②在Pro-Caspases的N端均含有一段P2-P27的前区域（Prodomain）。③活性形式均是由2个大亚基（17~20KD）和2个小亚基（10~12KD）组成的杂四聚体。一分子Pro-Caspase只能分裂产生1个大亚基和1个小亚基。④在大亚基的C端均含有QACXG（X=R.Q或G）的活性中心，其中Cys（C）是必需氨基酸，故Caspase是属于半胱氨酸蛋白酶类。（1）Caspases的分子的结构特征凋亡信号与死亡受体结合，经接应蛋白激活胱天蛋白酶，引发酶促级联效应，最终导致细胞解体。而Bcl-2家族中的抗凋亡（anti-apoptotic）成员或阻断死亡信号的传递，或抑制胱天蛋白酶的活化；促凋亡（proapototic）成员则通过竞争抑制抗凋亡成员的作用，或加速线粒体破坏等，促进细胞凋亡。我们将把讨论的重点集中于执行毁灭细胞功能的胱天蛋白酶。胱天蛋白酶的名称来自该酶的活性中心有催化作用的半胱氨酸残基，能水解底物蛋白中特异部位的天冬氨酸残基羧基侧肽键。该家族在哺乳动物中至少有14种，此类蛋白通常有酶前体和激活的酶两种类型。

Caspases酶原包含三个结构域：NH2末端结构域（Prodomain）、约20KD的大亚基和约10KD的小亚基。酶原的激活需要在大小亚基和N末端结构域内进行切割，形成具有两个独立活性位点的四聚体，这就是被激活的酶。

凋亡的调控凋亡相关基因抑制凋亡基因：Bcl-2，EIB，IAP促进凋亡基因：wtP53，Bax，ICE双向调控基因：c-myc，Bcl-xcaspase前体多肽链酶原裂解位点识别序列底

物氨基酸残基数分子量（kDa）CED-353062DSVDDETD

caspase-140445WFKDWEHDpro-IL-1β,pro-caspas-3、4caspase-243548DQQDDEHDPARPacaspase-327732IETDDEVDPARP，

DNA-PK，SREBPb，rho-GDIcaspase-437743WVRD(W/L)EHDpro-caspase-1caspase-541847.7WVRD(W/L)EHD

caspase-6—34TEYDVEHD

caspase-730435IQADDEVDlaminAcaspase-847955VETDLETDPARP,pro-caspase-6caspase-941446PEPDLETDpro-caspase-3,-4,-7,-9,-10caspase-1049755IEADLENDPARPcaspase-1137342****

caspase-12——****

caspase-1337743WVRDWEHD

caspase-1425729.5TYIDWEHD

表5.4caspase蛋白酶家族a.PARP:poly(ADP-ribosal)polymerase;b.SREPB:sterolresponseelementbindingprotein

已命名的caspase家族成员均已被克隆，不但具有氨基酸序列同源性，而且空间结构也很相似。根据caspase-1（ICE）和caspase-3（CPP32）的X-射线晶体图像，大亚基的C-端和小亚基的N-端共200多个氨基酸残基的序列尤为保守，组成相似的β折叠中心和相邻的α-螺旋。以caspase-1为例，它的活性中心由Cys-285、His-237和Gly-238组成，Arg-197、Arg341、Gln383和Ser347组成底物结合袋。

活性中心Cys近旁的序列也十分保守，一般是QACRG，在caspase-8和caspase-10中为QACQG，在caspase-9中为QACGG，其中的差异不影响它们的剪切活性的特异性。

除了与细胞死亡有关的蛋白酶granzyme（颗粒酶）B之外，只有caspase自己能激活pro-caspase。至少有几种pro-caspase有很低的酶促活性，当它聚集之后就启动自我加工。一旦有了活化的caspase，就像引发雪崩一样使其它的pro-caspase活化。

caspase进行自我切割和作用于其它靶蛋白时优先识别的四肽序列，P1位必须是Asp，P4位大多数为大的疏水残基，P2和P3变化较大（见表5.4），这可能是各个成员底物识别特异性之所在。caspase前体多肽链酶原裂解位点识别序列底

物氨基酸残基数分子量（kDa）CED-353062DSVDDETD

caspase-140445WFKDWEHDpro-IL-1β,pro-caspas-3、4caspase-243548DQQDDEHDPARPacaspase-327732IETDDEVDPARP，

DNA-PK，SREBPb，rho-GDIcaspase-437743WVRD(W/L)EHDpro-caspase-1caspase-541847.7WVRD(W/L)EHD

caspase-6—34TEYDVEHD

caspase-730435IQADDEVDlaminAcaspase-847955VETDLETDPARP,pro-caspase-6caspase-941446PEPDLETDpro-caspase-3,-4,-7,-9,-10caspase-1049755IEADLENDPARPcaspase-1137342****

caspase-12——****

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caspase-1425729.5TYIDWEHD

表5.4caspase蛋白酶家族a.PARP:poly(ADP-ribosal)polymerase;b.SREPB:sterolresponseelementbindingprotein（2）caspase的分类

根据序列同源性和底物特异性，可将caspase划分为3个亚类：（图5.10)①ICE亚类包括caspase-1、-4、-5、-13、-14以及小鼠caspase-11和-12；②CED-3亚类包括caspase-3、-6、-7、-8、-9、-10和CED-3；③第三亚类只有caspase-2图5.10caspase家族成员的序列同源性

人工合成的四肽底物YVAD和DEVD可分别阻断ICE亚类和CED-3亚类的活性，这些人工阻断剂与CrmA、p35等天然阻断剂被广泛应于细胞凋亡研究。按照在机体中的作用，caspase可划分成凋亡启动（initiator）亚类；凋亡效应（effector）亚类；细胞因子成熟（cytokinematuration）亚类（图5.11）。图5.11pro-caspase酶结构和底物专一性对比大亚基（空白矩形）与小亚基（暗色矩形）之间的裂解位点四肽已标出。**表示未知的裂解位点。DED：deatheffectordomains;CARD:caspaserecruit