选修一 53《血红蛋白的提取和分离》课件

专题5DNA和蛋白质技术

课题3血红蛋白的提取和分离1.说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法；2.说明凝胶色谱法的原理和方法；3.说出电泳的基本原理和方法；4.运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。以“蛋白质的合成”为背景材料，设计问题，导入新课；首先直接阐明蛋白质提取与分离的依据和原理，接着介绍凝胶色谱法的概念，原理及使用方法；再讲解缓冲溶液的概念，作用；电泳的概念，原理和类型；然后重点讲解血红蛋白的提取和分离过程及注意事项；最后通过课堂总结及课堂检测，完善内化课堂知识。

首先通过图片了解血红蛋白的组成，再以鸡血细胞为例，通过洗涤红细胞，释放血红蛋白，分离血红蛋白，透析血红蛋白等一系列实验步骤详细了解具体实验，通过实验提高学生的实际动手能力，并通过实验更好的理解蛋白质提取与分离，为以后的学习打下良好的基础。蛋白质的合成思考1：分离生物大分子的基本思路是什么？

思考2：蛋白质的分离和提取的原理是什么？

思考3：人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的

红细胞提取血红蛋白的原因是什么？一、基础知识蛋白质提取与分离的依据－－

蛋白质的物理化学性质差异1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度4.吸附性质5.对其他分子亲和力

1.方法及原理各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同电泳法根据相对分子质量的大小分离蛋白质凝胶色谱法原理方法血红蛋白的提取和分离凝胶色谱法1.概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。性质：微小的多孔球体本质：多糖类化合物实例：葡聚糖、琼脂糖2.原理：当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，

促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子

相对分子质量大小直径大小大于凝胶颗粒孔道直径小于凝胶颗粒孔道直径运动路径被阻挡在凝胶颗粒外面而迅速通过因扩散进入凝胶颗粒内部而被滞留运动速度较快较慢运动路程较短较长洗脱次序先后缓冲溶液1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。2、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。3、配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。还记得人体血液中的缓冲液吗？H2CO3/NaHCO3

NaH2PO4/Na2HPO4你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？目的是什么？本实验使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2、原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。电泳3、类型：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳应用：测定蛋白质分子量、进行蛋白质纯度鉴定原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS：消除净电荷对迁移率的影响。二、实验操作－－实验步骤

血液组成成分

1.洗涤红细胞

2.释放血红蛋白

3.分离血红蛋白

4.透析血红蛋白样品处理和粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的组成β

βα

α血红素基因可携带一分子O2或一分子CO2

水分血浆

固体物质血液

白细胞

血细胞血小板

红细胞血红蛋白（90％）1.洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？

洗涤干净的标志是什么？血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂滤纸过滤脂类物质3.分离血红蛋白分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管烧杯有机溶剂血红蛋白20mmol/L磷酸缓冲液4.透析血红蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血红蛋白中的小分子杂质纯化－－凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5－193.样品的加入和洗脱步骤操作要求①②③④⑤立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱材料：交联葡聚糖凝胶G-7520mmol/L磷酸缓冲液“G”表示什么？75代表什么？色谱柱内不能有气泡；装完后，立即用缓冲液洗涤，平衡凝胶使凝胶装填紧密。样品的加入和洗脱

1.调液面2.加样3.再调液面

4.洗脱5.收集缓冲液凝胶结果分析与评价血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出分离成功血红蛋白的分离放一支与凝胶柱垂直的日光灯直接检查加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整→装填成功凝胶色谱柱的装填分层明显→样品处理完成分层不明显的原因血液样品的处理分析项目洗涤次数少，未能除去血浆蛋白离心速度过高和时间过长1.红细胞的洗涤：

洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.色谱柱的装填：

装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。3.凝胶的预处理：

沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。4.

色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。血红蛋白的提取和分离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定1.随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是（

）A.弄清各种蛋白质的空间结构B.弄清各种蛋白质的功能C.弄清各种蛋白质的合成过程D.获得高纯度的蛋白质D2.使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于（）A.电荷的多少

B.分子的大小C.肽链的多少D.分子形状的差异B3.用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是（

）A.相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子

质量较大的蛋白质B.相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子

质量较大的蛋白质C.相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子

质量较大的蛋白质D.二者根本无法比较A4.在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是（）A.调节pHB.维持红细胞的能量供应C.防止微生物生长D.防止血液凝固D6.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的