L-天冬酰胺酶的生产工艺PPT

生工本2009级4班刘培培20092513418L-天冬酰胺酶的生产工艺LOGO（一）天冬酰胺酶的化学组成和性质

天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，用于治疗白血病。1922年Clementi发现豚鼠血清中存在天冬酰胺酶；1953年Kidd发现豚鼠血清中有抑癌作用的物质，其活性成分是蛋白质；1961年Broome确定了其有效成分是天冬酰胺酶，后来，Mashburn等报告指出从大肠杆菌中分离出天冬酰胺酶，具有同样抗癌活性。天冬酰胺酶呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮三氯甲烷乙醚和甲醇，水溶液20℃储存7d，5℃储存14d均不减少酶的活力。干品50℃15min酶活力降低30％，60℃1h内失活，最适PH8.5，最适温度37℃。

（二）国内天冬酰胺酶的发展历程目前,国内临床上应用的L2ASP主要来源于大肠杆菌,我国天津生化厂于1974年开始生产E1coli天冬酰胺酶,但由于菌种产酶能力低,提取精制工艺落后,难以与国外产品竞争,再加之其他原因最后停产。为了填补国内空白,1995年,中国药科大学吴梧桐教授等率先进行了E1coli天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研究,并首次在国内成功构建了高效表达L2ASP的基因工程菌pKA/CPU210009,工程菌发酵单位比野生株高出100倍。随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺,确定了重组L2ASP的纯化路线,并对重组产品进行了鉴定。结果表明,基因工程菌生产的产品质量与天然品从基因序列、蛋白质一级结构到蛋白质的物理化学性质等方面均一致,两者具有同质性

。这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用E1coliL2ASP开辟了新的道路。（三）抗肿瘤机制

L2ASP抗肿瘤的作用机制在于它能够降低人体内L2天冬酰胺和L2谷氨酰胺的浓度,这两种氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶,不能合成L2天冬酰胺,需酸是合成嘌呤环和嘧啶环的重要组成部分。肿瘤细要摄取外源L2天冬酰胺才能存活。当外源L2天冬酰胺被分解掉时,癌细胞合成核苷酸和蛋白质的能力就会显著降低,因此L2ASP能有效抑制肿瘤细胞的增殖。有研究表明,L2ASP能够选择性抑制体内Ra2pamycin2靶标信号传导通路,从而抑制肿瘤的增值

。另有文献报道,L2ASP在体内发挥作用时可能是通过一种功能性的p53蛋白因子来介导肿瘤细胞的凋亡

。（四）工艺流程大肠杆菌产生的L2ASP包括L2ASPⅠ和L2ASPⅡ,其中L2ASPⅠ存在于细胞质中,与底物L2天冬酰胺的亲和力很小(Km=1×10-3mol/L),没有抗肿瘤活性;而L2ASPⅡ则分泌在细胞周质中,与L2天冬酰胺有很高的亲和力(Km=1×10-5mol/L),有抗癌活性[3]。现今,产生L2ASPⅡ的菌种主要包括Escherichiacoli、Erwiniacarotovara、Serraliamarcescem、PseudomonasSp1、Wolinellasuccinogenes等。主要采用的提纯方法包括硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、离子交换层析法、超滤、水系二相胶束系统、分批式吸附和直行式解吸附法、渗透休克法以及亲和层析法等[8～16]。采用不同方法最终得到目标产物的酶活力范围为220～520157U/mg,总回收率为31%～86%。天冬酰胺酶工艺流程图

大肠杆菌→肉汤菌种→种子菌种→发酵液→菌体→提取液→上清液→沉淀→洗脱液→洗脱液→冻干→

L-天冬酰胺酶[菌种培养]肉汤培养基37℃48h玉米浆培养基37℃4-8h[种子培养][发酵]玉米浆培养基37℃6-8h[离心][提取]蔗糖抽提液PH7.530℃[分级沉淀]（NH4)2SO455％饱和度PH7.0[分级沉淀]（NH4)2SO490％饱和度[离子沉淀]DEAE-纤维素(DE52)[离子交换]CM-纤维素(CM52)工艺过程及要点1菌种培养采用大肠杆菌EscherichiacoliA.S.1.357,培养基加牛肉汁100mL,蛋白胨1g,氯化钠0.5g,琼脂2-2.5g37℃,在试管中培养24h，茄形瓶培养8h，锥形瓶培养16h。2种子培养培养基用玉米浆30kg，加水至300kg，接种量1%-1。5%，37℃，通气搅拌培养4-8h.一、总述3发酵罐培养取玉米浆100Kg，接种量8%，37℃，通气搅拌培养6-8h，离心分离发酵液，得菌体加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。4蔗糖溶液抽提将菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖溶液（蔗糖40%溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5),30℃振荡2h,8000r/min离心，收取上层酶液。5硫酸铵分级沉淀取上述酶液，加入（NH4)2SO4至55%饱和度，调PH至7.0，室温搅拌1h，离心除去沉淀，取上清液加入（NH4)2SO4到90%饱和度，离心收集沉淀。6纯化将沉淀用50mmol/L,PH7.0磷酸缓冲液溶解并透析，透析后的酶液，通过预先用10mmol/L，PH7.6磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素层析柱（1cm×30cm）,用30mmol/L磷酸缓冲液洗脱，流速为40mL/h,收集天冬酰胺酶活性组分，再调整PH4.8,通过预先用50mmol/L,PH4.9的磷酸缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱（1cm×8cm）,用50mmol/L,PH5.2的磷酸缓冲液洗脱，收集酶活性组分，冷冻干燥，即得L-天冬酰胺酶冻干粉，总收率为31%，比活为220U/mg蛋白。二、工艺流程图（1）丝状菌三级发酵工艺流程

冷冻管（25°C，孢子培养，7天）——斜面母瓶（25°C，孢子培养，7天）——大米孢子（26°C，种子培养56h）——一级种子培养液（27°C，种子培养，24h）——二级种子培养液（27~26°C,发酵,7天）——发酵液。

（2）球状菌二级发酵工艺流程

冷冻管（25°C，孢子培养，6~8天）——亲米（25°C，孢子培养，8~10天）——生产米（28°C，孢子培养，56~60h）——种子培养液（26~25-24°C，发酵，7天）——发酵液。三、青霉素发酵过程青霉素发酵时，青霉素生产菌在合适的培养基、PH、温度和通气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素。发酵开始前，有关设备和培养基（主要是碳源、氮源、前体和无机盐等）必须先经过灭菌，后接入种子。在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，在发酵过程中往往要加入泡沫剂，假如酸碱控制发酵液的PH，还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合物以补充碳源及氮源，或补进其他料液和前体等以促进青霉素的生产。青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、青霉素合成和菌体自溶三个阶段。菌体生长阶段：发酵培养基接种