第五章-三帖皂甙类制剂的分析

第三节三帖皂苷类成分分析本节要求1.了解皂苷的理化性质2.熟悉含皂苷类制剂供试液的提取纯化制备方法3.掌握含皂苷类制剂的定量测定原理和方法4.掌握含皂苷类制剂的定性鉴别的原理和方法一、概述

二、结构特征及理化性质

三、皂苷类成分的定性鉴别

四、皂苷类成分的定量分析

五、应用实例

内容苷类（glycosides）稀酸或酶水解后产生糖和非糖两部分的化合物。一般为活性成分，如强心苷、皂苷等。无色、无臭晶体。溶于水、乙醇，难溶于亲脂性有机溶剂；苷元则相反。

人参皂苷

皂苷概述*定义：皂苷大多数是指螺甾烷及其生源相似的甾族化合物的低聚糖苷或三萜类化合物的低聚糖苷。具有发泡、溶血等特性。组成皂苷元：甾体皂苷元（27个C，合成激素的原料）三萜皂苷元（30个C，生理活性成分）糖：多分子糖或糖醛酸皂苷的分类按苷元分为两大类：甾体皂苷：――27个Ｃ组成的甾体衍生物。三萜皂苷：――30个C组成的三萜衍生物，大多数三萜化合物均可看作有6个异戊二烯单位连接而成。游离的三萜类化合物通常多不溶于水，与糖结合后成苷，则可溶于水，振摇后可生成胶体溶液，并有持久性似肥皂溶液的泡沫。五环三萜皂苷

β-香树脂醇型（齐墩果烷型）α-香树脂醇型（熊果烷型）羽扇豆醇型四环三萜皂苷达马烷型羊毛脂甾烷型其他分类单皂苷：中性皂苷、酯皂苷、酸性皂苷

双皂苷（2）*三萜皂苷（酸性皂苷）含三帖类成分的常用中药人参西洋参三七黄芪柴胡甘草桔梗远志酸枣仁三萜类化合物是中药中一类主要有效成分，具有多方面的生理活性。如人参皂苷可促进RNA蛋白质的生物合成调节机体代谢，增强免疫功能；柴胡皂苷有抑制中枢神经系统和明显的抗炎症作用，并能减低血浆中胆固醇和甘油三酯的水平；七叶皂苷有明显的抗渗出、抗炎、抗瘀血的作用；甘草皂苷有促进肾上腺皮质激素样作用，并能防治肝硬化、抗动脉粥样硬化、抗溃疡等作用；还有一些苷皂类化合物有抗肿瘤活性。二、物理性质性状多数为无色或乳白色无定形粉末，少数为晶体；多数有苦、辛辣味，对粘膜有刺激性；有吸湿性。*溶解性

(掌握）皂苷元：不溶于水，而溶于石油醚、C6H6、Et2O、CHCl3；酸性皂苷元可溶于碱水

皂苷:易溶于水，热甲醇、乙醇。

在含水丁醇/戊醇中溶解度较大。不溶于Et2O、CHCl3等。皂苷类化合物的溶解性一般规律含有皂苷类成分的中药制剂在进行成分分析时，供试液制备常依据其溶解性特点选择提取溶剂及方法供试液制备常用方法及溶剂选择（掌握）皂苷元的提取一般步骤

酸水解-有机溶剂提取法

物理性质*发泡性皂苷能降低水溶液的表面张力，振摇后产生持久性泡沫。

*

物理性质*溶血性皂苷有使红细胞破裂的作用，用溶血指数表示。溶血指数：对同一动物来源的红细胞稀悬浮液，在同一条件下造成完全溶血的最低浓度。如薯蓣皂苷1:400000（毒性大）溶血作用与分子结构的关系：皂苷元决定有无溶血作用；糖决定溶血作用的强弱。单糖链皂苷较显著；酸性皂苷中等；中性三萜皂苷最弱。皂苷消化道不吸收，口服无毒，胆甾醇能解皂毒。

物理性质熔点皂苷无明显熔点(dec.)；苷元熔点随羟基数目增加而升高(单-OH<208℃,三-OH>240℃)；甾体皂苷鉴定时不能单靠熔点（混熔点不降）。旋光度甾体皂苷及苷元均为左旋，且与双键有关。未饱和的苷元或乙酰化物均较相应的饱和物为负（左旋）。

化学性质金属盐类的反应：皂苷水溶液与铅盐、钡盐、铜盐等产生沉淀

酸性皂苷：与硫酸铵、硫酸铝或其他中性盐类生产沉淀

中性皂苷：与碱式醋酸铅或氢氧化钡等碱性盐类产生沉淀可进行含皂苷类成分制剂的提取和粗分离化学性质显色反应：无水条件下（１）醋酐－浓硫酸反应：Liebermann-Burchard反应

试剂：醋酐－浓硫酸（20：1）

样品＋醋酐1ml—→沿壁加入浓硫酸（20ml)—→两液层中间出现色环。

甾体皂苷：色环为蓝色或蓝绿色。阳性。三萜皂苷：色环为红、粉红或紫色。阳性。

主要用于化学鉴别化学性质（2）三氯醋酸反应：Rosen-Heimer反应

试剂：25％三氯醋酸氯仿溶液样品液＋滤纸上—→滴三氯醋酸试剂—△—→观察△→60℃观察斑点：→红色…→紫色斑点甾体皂苷阳性△→100℃观察斑点：→红色…→紫色斑点三萜皂苷阳性用于化学及色谱鉴别的显色剂化学性质（３）五氯化锑反应：Kahlenberg反应

试剂：20％五氯化锑氯仿溶液样品氯仿液＋五氯化锑氯仿液—→氯仿液呈紫蓝色。用于化学及色谱鉴别的显色剂黄芪甲苷光谱特征光谱特征甘草酸/甘草皂苷/甘草甜素远志皂苷三、皂苷类的定性鉴别：皂苷类的定性鉴别较常用的有泡沫反应鉴别化学显色反应鉴别

薄层色谱鉴别：中药制剂鉴别应用准确率较高中药材成分鉴别泡沫反应鉴别：

中药粉末１g＋水10ml—△→滤液→强烈振摇

—→泡沫15min以上不退

阳性。

滤液＋0.1mol/LHCl5ml—→强烈振摇—→……＋0.1mol/LNaOH5ml－→强烈振摇—→…若两管泡沫高度相同，则含三萜皂苷；若碱管较酸管泡沫高数倍，则含甾体皂苷。

（当中药制剂中皂苷含量较高时，可参考此法鉴别。但需注意排除干扰、空白对照。）化学显色反应鉴别：例复方丹参片处方：丹参浸膏、三七、冰片。

其中三七皂苷的鉴别可用显色法样品５片＋水洗涤去糖衣—→研细＋无水乙醇10ml—→振荡提取→滤过→滤液５ml蒸干＋五氯化锑氯仿饱和液—→显紫蓝色注：此类显色反应在中药制剂分析中，因组分多，干扰大，应用较少。薄层色谱鉴别因皂苷类成分大多无明显的紫外吸收，故经薄层分后，用适当的显色剂显色，是皂苷各组分定性鉴别最常用的方法。

阳性对照：可用被检测的皂苷类成分对照品或对照药材。薄层板：常用硅胶或氧化铝

展开剂：其配比可根据需要加以调整。薄层色谱鉴别皂苷：极性较大，一般用分配层析效果好展开剂极性要较大---亲水性强适合的展开剂：CHCl3-CH3OH-H2O(10℃以下放置，13:7:2下层),水饱和C4H9OH，CHCl3-CH3OH(7:3),C4H9OH-EtOAC-H2O(4:1:5),EtOAC-吡啶-H2O(3:1:3),CHCl3-C2H5OH(7:3)等。

薄层色谱鉴别皂苷元：极性较小，亲脂性强，吸附、分配薄层均可。用硅胶为吸附剂，则要求展开剂的亲脂性强。适合于皂苷元常用展开剂有：环已烷-EtOAC(1:1),C6H6-EtOAC(1:1),CHCl3-EtOAC(1:1),CHCl3-EtOEt(1:1),C6H6-EtOH(17:3)。常用的显色剂①25％磷钼酸乙醇液：喷后140℃,△5～10min,皂苷元紫蓝色。5％磷钼酸乙醇液：喷后105℃,△5～10min，皂苷元紫蓝色②、三氯化锑的浓盐酸或氯仿液:喷后90℃,△10min，各皂苷元呈不同颜色。③、硫酸-甲醇液(1:1):喷后△，显红褐、紫、黄或黑色。与加热温度有关。缺点是腐蚀性强,其他物质也显色。④、氯磺酸-乙酸(1:２)溶液:喷后130℃,△５min，各皂苷元呈不同颜色。如天蓝、粉红等,且在紫外光下也呈不同萤光，较灵敏（可检出１０－１～１０－３ug）,可用于鉴别和定量。⑤、碘蒸汽:灵敏度约为１～２ug，优点碘易挥发，显色后挥去碘，斑点可作定量分析。常用于确定斑点的位置。缺点专属性不强.。常用的显色剂10％硫酸乙醇溶液：最常用的显色剂配制方法：取10ml硫酸,用乙醇稀释至100ml特点：与加热温度有关；腐蚀性强；其他成分也可显色薄层色谱1.

薄层板的制备：吸附剂的选择

2.供试液制备（掌握）:溶解性/对照物溶液的制备3.

展开剂的选择：与被测物结构的极性大小、溶解度以及吸附剂的活度密切相关4.点样5.展开6.晾干、显色7.斑点的检视、薄层鉴别的判断、或定量8.薄层板的记录四、皂苷类的定量分析

总皂苷测定：醇提水饱和正丁醇萃取或大孔树脂吸附洗脱测定-常用重量法、比色法

皂苷元测定：总皂苷酸解苷元测定——比色法、薄层色谱法、高效液相色谱法

单体皂苷测定：薄层色谱法、高效液相色谱法但在中药制剂中如无特殊原因，应尽量避免将药品水解后测定水解产物，因为如此测定已不能客观反应药品自身的质量，更无法进行稳定性考察总皂苷测定重量法：根据皂苷类成分的溶解性进行提取、分离及纯化后得到总皂苷，恒重、称量，并计算样品中总皂苷含量。一般少用，主要用于含皂苷的原料药质量控制。如甘草浸膏中甘草酸含量测定比色法一般指供试品连续两次干燥或炽灼后的重量差异在0.3mg以下的重量总皂苷测定比色法：利用皂苷能与某些试剂反应后产生颜色，然后于可见光区进行比色测定。显色后能在紫外光区产生吸收，用UV测定专属性差，但反应灵敏、方法简便、易行常用的显色试剂测定总皂苷、总皂苷元的含量时，可用单体皂苷或皂苷元作对照常用的皂苷显色剂①浓硫酸测定甾体皂苷的通用试剂。甾体皂苷常显黄色(80～90℃反应30～60min）。②高氯酸测定具△5的苷元,因△5不饱和结构与高氯酸在室温下即可生成黄色。如：薯蓣皂苷元，10’、410nm、30’内稳定,25～200ug符合比尔定律.③浓硫酸－醋酐、硫酸－醋酐－冰醋酸、硫酸－冰醋酸试剂：主用于检测甾体皂苷。如：人参总皂苷,60℃、25min,520nm测定.甘草次酸在529nm测定.④芳香醛-硫酸或芳香醛-高氯酸主用干检测三萜皂苷，甾体皂苷也可用。需注意控制反应条件.⑤其他试剂：如亚甲蓝与甘草酸结合物，640nm比色。2,6-二丁基对甲酚与甘草酸呈色,575nm比色。复方丹参片中三七皂苷的含量测定——大孔树脂分离－比色法复方丹参片05版药典：HPLC法测定丹参酮IIA，丹参酚酸B大孔树脂：大孔树脂规格的选择：1.大孔树脂性质与吸附物质的性质遵循相似性相吸的原则。极性较大的化合物一般适合在中等极性以上性质的大孔树脂上分离，极性小的化合物适合在非极性的大孔树脂上分离。比如用大孔树脂分离银杏黄酮S-8极性：吸附量126.7mg/gAD-8弱极性：吸附量102.8mg/gH-107非极性：吸附量47.7mg/g银杏黄酮具有多酚结构和糖苷链，具有一定吸附和亲水性，有利于弱极性和极性大孔树脂吸附大孔树脂规格的选择：2.被吸附物质分子的大小和树脂孔径的关系。大孔树脂的吸附量大小受树脂极性和骨架结构影响外，还受到树脂空间结构的影响。树脂吸附过程中，树脂内部孔径是被吸附物质扩散的路径，在比表面积一定的情况下，适当增加树脂孔径，亦会增大被吸附物质的扩散速度，有利于达到吸附和解析平衡比如不同规格的大孔树脂对大豆皂苷的分离聚苯乙烯型大孔吸附树脂ZTC-1（孔径13-30nm）和X-5（孔径29-30nm）吸附量大，ZTC-1：吸附量大、解析容易、吸附速度快X-5：解析率较高，但吸附容量偏低影响大孔树脂分离纯化效果的因素1.被吸附物质溶液的ph值：由于PH值影响有效成分的解离度，从而影响到有效成分被大孔树脂吸附的难易程度。一般情况下，酸性物质易在适当酸性溶液中被吸附，碱性物质在适当碱性溶液中易被吸附，中性物质可在接近中性条件下被吸附。2.被吸附物的上样浓度：一般被吸附物浓度增加吸附量也随之增加，但被吸附物浓度增加有一定的限度，不能超过大孔树脂的吸附容量。影响大孔树脂分离纯化效果的因素3.上柱温度和无机盐浓度：由于吸附过程是一个放热的过程，温度过高会影响吸附效果，室温对吸附性能影响不大，柱温超过50℃时，吸附量明显下降4.树脂柱的径高比：树脂柱内径与柱高的比例也是影响树脂吸附效果的因素之一，合理的径高比可为分离提供较高的柱效，更有利于大孔吸附树脂对中草药有效成分的吸附与分离。影响大孔树脂分离纯化效果的因素5.吸附流速：吸附流