重症医学：血必净注射液对创伤后内皮细胞合成血管生成素2及血管内皮钙粘蛋白的影响

PAGEPAGE92及血管内皮钙粘蛋白的影响摘要:【目的】70（eHSP70）2(Ang-2)及血管内皮钙粘蛋白方法】RT-qPCR和WesternbloteHSP70（终浓度为0.1ug/ml）0、2、4、8、1632hAng-2、VE-cadherinmRNA和eHSP70（终50mg/m、血必净+eHSP7（0.1ug/mleHSP701h，50mg/ml血必净RT-qPCR和WesternblotAng-2、VE-cadherinmRNA结果】eHSP70Ang-2mRNA4hVE-cadherinmRNAeHSP704h4h后，eHSP70组与血必净+eHSP70Ang-2mRNA及蛋白表达量明显较空白对照组的表达量增高（<0.0，而血必净+eHSP70组Ang-2的mRNA及蛋白表达量较eHSP70eHSP70VE-cadherinmRNA及蛋白的表达量明显降低<0.0，而血必净+eHSP70VE-cadherinmRNA及蛋白的（<0.05（<0.0【结论】eHSP70模拟的创伤刺激能导致损伤的内皮细胞Ang-2VE-cadherineHSP70Ang-2与VE-cadherin的表达影响，对创伤刺激的血管内皮细胞具有保护作用。关键词；血必净注射液；细胞外热休克蛋白70；血管生成素2；血管内皮钙粘蛋白；内皮细胞1作者简介：汤建勇1989E-mail:tjy_125@163.com1970（编号：A2009484）近期研究表明，机体受到创伤、低氧等刺激后可以释放损伤相关模式（DAMP）分子，与病原体相关模式(PAMP)分子协同作用激活先天免疫系统促发炎症反应进而造成血管内皮的功能障碍[1]eHSP70是DAMP是血管内皮损伤的生物标志物，本课题前期研究表明Ang-2是影响脓毒症患者病情严重程度的独立危险因素[2]。血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin）作为细胞粘附连接中的重要组成蛋白，对内皮细胞通透性影响十分显著[3]eHSP70对内皮细胞及VE-cadherin后内皮功能障碍治疗的新手段提供理论依据。材料与方法细胞株人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）临床医学研究中心何惠娟老师赠送。主要试剂和仪器70（ProSpe；DMEM(国Gibco；胎牛血清（Gibco美洲；逆转录试剂盒（KP106-02）及荧光定PCRTIANGEN2（abcaELISA试剂盒RD公司TrizolInvitrogen公司；引物（上海生工；血必净注射液（主要成份为红花、赤芍、川芎、丹参、当500g/10m/04202；ABI7500PCR（德国Bio-Rad（美国Bio-Rad（美国细胞培养HUVECs3-862%FBSDMEM培养液培养12hG0期用于实验。实验干预处理eHSP700.1ug/ml）0h、2h、4h、8h、16h、32h这六个时间RNA以明确最佳刺激时间。eHSP70组：无血清培养基含细胞外热休克蛋白70(终浓度0.1ug/mL)[4][5]eHSP70+依次加入细胞外热休克蛋白70(终浓度0.1ug/mL)，1h后加入血必净（终浓度为50mg/ml）继续培养；各组总培养时间为最佳刺激时间，然后收集细胞提取总RNA和蛋白进行检测。实时荧光定量PCR分析Ang-2B-catenin从GenBank获取待测基因的cDNAPrimerPremier5.0物5’-AACTTTCGGAAGAGCATGGAC-3’，反向引物5’-CGAGTCATCGTATTCGAGCGG-3’；VE-cadherin正向引物5’-AGGACATAACACCACGAAACG-3’，反向引物5’-CGGTCAAACTGCCCATACTT-3’；GADPH正向引物5’-GGGTGTGAACCATGAGAAGT3’，反向引物5’-CAGTGATGGCATGGACTGTG3’TrizolRNA并测定纯度和浓度,取每组RNA各1μg,反转录成cDNA,使用含SYBRGreenI96孔PCRABI7500荧光定量PCR测Ang-2、VE-cadherin以及内参基因GADPH的表达。反应体系为10μL，每种待测基因均行3复孔检测,实验重复3次,采用2-△△Ct法计算基因表达倍数。Western检测Ang-2VE-cadherin蛋白的表达 收集上述各时间组及药物处理组细胞，并提取细胞总蛋白法进行蛋白定量。各组取总蛋白约30ug进行凝胶电泳后，转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温下封闭1h后分别加入兔抗人Ang-2多克隆抗体兔抗人VE-cadherin单克隆抗体兔抗人GAPDH单克隆抗体（工作浓度分别1:5001:5000孵育过夜，次日加入二抗（工作浓度为1:5000），室温孵育1h后用超敏ECL化学发光试剂盒显色，于暗室曝光，各组实验重复三次，条带使Image分析软件分析灰度值。1.8统计学方法应用SPSS17.0软件对所有数据进行统计分析，结果采用x s表示，各组间均数的比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。结果不同时间点的eHSP70刺激后内皮细胞的Ang-2及VE-cadherin表达变化内皮细胞的Ang-2及VE-cadherinmRNA水平变化图1a结果显示：经eHSP700hAng-2mRNA表达均显著<0.04hAng-2mRN图1beHSP700h组相比较，其它各时间组内皮细胞VE-cadherin的mRNA表达量均显著降低（P<0.054hVE-cadheri的mRNA表达均显著增高（<0.05。图1 eHSP70刺激后各时间组细胞Ang-2、VE-cadherinmRNA表达（x s注释：与0h组相比较，▲P<0.05；与4h组相比较，★P<0.05内皮细胞的Ang-2及-catenin蛋白水平变化图2和图3结果显示：与0h组相比，其它各时间组内皮细胞Ang-2的蛋白表达均显著增加（<0.054h组相比，Ang-2的蛋白表达均显著降低（<0.05；图2和图3b结果显示：与0h组相比，其它各时间组内皮细胞VE-cadherin的蛋白表达量均显著降低<0.04hVE-cadheri（<0.0。图2 eHSP70刺激后各时间组细胞Ang-2VE-cadherin蛋白表达凝胶电泳图图3 eHSP70刺激后各时间组细胞Ang-2、VE-cadherin蛋白表达（xs注释：与0h组相比较，▲P<0.05；与4h组相比较，★P<0.05eHSP70刺激4h后各实验组之间细胞Ang-2和VE-cadherin的表达水平变化各实验组之间细胞Ang-2和VE-cadherin的mRNA水平变化图经eHSP70刺激4heHSP70组及eHSP70+血必净组的内Ang-2mRN表达量均显著增加<0.0，而血必净组无统计学差异P＞0.05；与eHSP70组相比较，血必净组及eHSP70+血必净组表达量均较之显著<0.04beHSP70刺激4heHSP70组VE-cadherin的mRNA表达量显著降低（P<0.05，血必净组及eHSP70+血必净VE-cadheri的表达增高（<0.0，其中尤以血必净组增高为显著（<0.0图4各实验组细胞Ang-2、VE-cadherinmRNA表达的影响（xs注释：与空白组对比较，▼P<0.05；与eHSP70组对比较，■P<0.05。各实验组之间细胞Ang-2和VE-cadherin的蛋白表达水平变化图5和图6a果显示：经eHSP70刺激4heHSP70组及eHSP70+净组的内皮细胞Ang-2蛋白表达量均显著增加（<0.05，而血必净组无统计学差异＞0.05eHSP70eHSP70之显著下降（<0.05；图5和图6b结果显示：经eHSP70刺激4h后，与空白对照eHSP70组VE-cadheri的蛋白表达量显著降低<0.0eHSP70+血必净组VE-cadherin的表达增高（P<0.05，其中尤以血必净组增高为显著<0.0。5Ang-2、VE-cadherin蛋白表达电泳图图6 各实验组细胞Ang-2、VE-cadherin蛋白表达影响的电泳（x s注释：与空白组相比较，▼P<0.05；与eHSP70组相比较，■P<0.05。4讨论研究表明，eHSP70在创伤等应激后循环血液和体液中会明显增加[6-7]。早期GanterMD证实[8]Ang-2呈现明显上升。那么Ang-2作为血管内皮细胞损伤的重要生物标志物，在创伤患者中的升高是否与eHSP70eHSP70作为DAMP的一员，其受体与PAMP分子中的细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)相似，主要通过的Toll样受体(Toll-likereceptor,中的TLR2和TLR4进行信号传导，诱发炎症因子的转录和表达[4]Ang-2与脂多糖（LPS）呈正相关[2]eHSP70可能通过调控Ang-2的表达从而进一步导致内皮功能障碍。由于eHSP70能促进多种炎症因子的释放，并且机制复杂，关于eHSP70刺激Alexzander使用eHSP70刺激外周血单核细胞2小时后，白介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎症因子明结果显示：eHSP70刺激后，各时间组内皮细Ang-2的4h达到表达峰值，提示4h是eHSP70佳刺激时间，这与Alexzander结果较为一致。本实验证Ang-2表达具有上调作用，这为今后创伤后炎症损伤的研究提供了一定的理论依据。[9-10]，其对eHSP70升高引起内皮功能障碍取得了一定进展。DeMaio[11]的研究表明能够影响内皮细胞缝隙连接,VE-cadherin通过与β-catenin结合形成VE-cadherin/β-catenin复合体是内皮粘附连接的关键因素[12]粘附连接蛋白表达的可调控性，对内皮细胞通透性影响十分显著。但目前关于eHSP70是否通过调控VE-cadherin的表达进而导致血管通透性增加、炎症因子渗漏的文章鲜有报道。本次实验显示经eHSP70VE-cadherin的mRNA和蛋白表达量较空白组明显降低，提示eHSP70通过对VE-cadherin的作用导致内皮通透性增加。Ang-2表达上调，但对正常的内皮细胞Ang-2表达无明显影响；此外血必净也显著减弱了eHSP70对VE-cadherin表达的抑制作用，并且还能上调正常内皮细胞VE-cadherin的表达。张宏业等[14]证实血必净注射液作用后，急性缺血性脑卒中并发SIRS患者血清中TNF-αIL-6[15]等体外研vWF）及内皮素（ET）含量明显下降，提示血必净对[16]HMGB-1、RAGE等促炎因子的释放，结合上述研究提示血必净既能抑制感染引起的炎症作用，也能抑制创伤引起的炎症反应。综上所述，eHSP7能诱导Ang-2的表达，同时抑制VE-cadherin的表达，其诱导作用于4h最显著，血必净能明显抑制eHSP70对内皮细胞的上述作用。因此，我们认为血必净注射液不仅能拮抗脓毒症引起的炎症反应，而且对创伤后eHSP70引起的内皮损伤具有显著的保护作用。这为今后血必净在创伤炎症方面的治疗提供了新的研究方向和理论依据。综上所述，参考文献:BartonGM.Acalculatedresponse:controlofinflammationbytheinnatesystem.JClinInvest,2008,118(2):413-420. 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