3.2.1 基因工程的基本操作程序 知识（38）新教材 20202021学年人教版（）高二生物选择性必修三

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第2节

基因工程的基本操作程序

问题：

你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？

转基因抗虫棉

非转基因抗虫棉

基因工程的基本操作程序（四个步骤）

目的基因的筛选与获取

基因表述载体的构建

将目的基因导入受体细胞

目的基因的检测与鉴定

有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。

使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表述和发挥作用。

载体进入受体细胞稳定表述，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。

才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表述。

前提

核心

关键

保证

在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表述产物等的基因。

目的基因的筛选与获取

第一步

目的基因

根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。

目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因、人干扰素基因等。

如

与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。

转基因抗虫棉的抗虫机制

科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt

抗虫蛋白抵抗虫害。

目的基因

转基因抗虫棉

苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt

抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。

筛选合适的目的基因

从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一。

随着测序技术的发展，序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等的应用，更多的基因的结构和功能为人们所知，为科学家找到合适的目的基因提供更多机会和可能。

筛选

Bt

基因作为培育转基因抗虫棉的目的基因。

如

目的基因的获取方法

利用PCR技术获取和扩增

cDNA文库

逆转录法

从基因文库中获取

人工合成

基因组文库

化学合成法

利用PCR获取和扩增目的基因

聚合酶链式反应(

Polymerase

Chain

Reaction

)的缩写。

PCR

美国科学家穆里斯等人发明

1993年获诺贝尔奖

DNA半保留复制的原理。

是一项在体外对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。

依据

原创

DNA复制的基本条件

参与的组分

在DNA复制中的作用

解旋酶

（体外-高温）

打开DNA双链

DNA母链

提供DNA复制的模板

4种游离的脱氧核苷酸

合成子链的原料

DNA聚合酶

催化合成DNA子链

引物

使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸

一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。

PCR的条件

（1）DNA（目的基因）模板。

（2）分别与模板DNA相结合的两种引物。

（3）A、T、G、C四种脱氧核苷酸。

（4）耐高温的DNA聚合酶。

（5）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。

（6）能严格控制温度的温控设备。

耐高温的DNA聚合酶

引物

四种脱氧核苷酸

DNA模板

PCR的反应过程

A．变性

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。

待扩增的DNA片段

B．复性

温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

C．延伸

温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

变性、复性和延伸三步反应完成后，一个DNA分子就复制成了2个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。

结果

完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物。

反应场所

在PCR扩增仪中自动完成的。

鉴定方法

模板DNA

利用PCR获取和扩增目的基因过程：

50℃

引物1

引物2

DNA引物

95℃

利用PCR获取和扩增目的基因过程：

引物1

引物2

DNA引物

72℃

Taq酶

Taq酶

利用PCR获取和扩增目的基因过程：

72℃

第1轮结束

第2轮开始

利用PCR获取和扩增目的基因过程：

95℃

50℃

72℃

Taq

Taq

Taq

Taq

利用PCR获取和扩增目的基因过程：

72℃

第2轮结束

利用PCR获取和扩增目的基因过程：

PCR技术与细胞内DNA复制的比较

{8799B23B-EC83-4686-B30A-512413B5E67A}

比较项目

细胞内DNA复制

PCR技术

区别

解旋方式

解旋酶催化

DNA在高温下变性解旋

场所

主要在细胞核内

细胞外(主要在PCR扩增仪内)

酶

解旋酶、DNA聚合酶等

热稳定的DNA聚合酶（Taq

酶）

温度

细胞内温和条件

控制温度，需在不同温度下进行

结果

合成整个DNA分子

扩增特定的DNA片段或基因

联系

①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板

②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）

③酶:均需DNA聚合酶

④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成

归纳比较

1、目的：

2）使目的基因能够表述和发挥作用。

2、组成：

a、目的基因

b、启动子

c、终止子

d、基因

1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以

遗传给下一代

基因表述载体的构建

第二步

——基因工程的核心

一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游（首端），紧挨转录的起始位点是RNA聚合酶的识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。

启动子

有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子。

诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表述。

终止子

一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的下游（尾端），标志着转录的停止。

作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，筛选含有目的基因的受体细胞。

基因

抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等。

如

a.目的基因

b.启动子

c.终止子

d.基因（抗生素抗性基因）

表述特定性状

位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点，基因转录的开始

位于基因的末端,终止转录

检测目的基因是否导入受体细胞

e、复制原点：DNA聚合酶结合位点

总结

基因表述载体的构建过程

3.将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。

2.用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。

1.用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端.

动物细胞

植物细胞

原核细胞（大肠杆菌、土壤农杆菌等）

将目的基因导入受体细胞

第三步

常用的受体细胞

针对不同的受体细胞，选用不同的方法。

导入植物细胞

②农杆菌转化法

我国科学家独创

①花粉管通道法

在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。

花粉

卵细胞

精子

花粉管

如

用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；

多种操作方法

农杆菌转化法

易感染双子叶植物和裸子植物；

内含Ti质粒，其上的T-DNA可转移至受体细胞的染色体DNA上。

农杆菌特点

Ti质粒

T-DNA

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表述的过程。

转化

Ti质粒

目的基因

构建

表述载体

导入

植物细胞

插入

植物细胞染色DNA

表述

新性状

转入

农杆菌

将从叶片取下的圆形小片与农杆菌共培养，筛选转化细胞，再生成植株；

随转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻

、玉米等单子叶植物也取得成功。

如

根据受体植物不同，具体转化方法有所区别

将花序浸没在含农杆菌的溶液中，培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定。

导入动物细胞

显微注射技术

受精卵

方法

注入

转化方法

将含有目的基因的表述载体提纯

取卵（受精卵）

显微注射

受精卵发育

获得具有新性状的生物

基因工程中，常用原核生物作为受体细胞。

1.繁殖周期短

2.体积小易于培养操作

3.多为单细胞，遗传物质相对较少

4.经济实用

导入微生物细胞

优点

感受态细胞法

大肠杆菌

感受态细胞吸收DNA分