9094纯度方法学验证

9094纯度方法学验证［摘要］目的确认建立的9094纯度检测方法的可行性.准确性及耐受性.为909纯度检验标准操作程序制定提供依据.方法高效液相色谱法色谱条件ODS-BP柱，以0.1%磷酸：甲醇=25:75为流动相UV检测器检测波长274nm.验证内容纯度测定方法的测定方法的专属性,确认样品检测性.定量限和浓度,并进行系统适应性，方法精密度，方法耐受性验证.结论该有关物质及纯度测定方法其专属性对高温降解检测均不符合验证可接受标准，系统适应性，方法精密度，方法耐用性均符合验证可接受标准.该纯度测定方法对于非高温接触的产品可靠，可行，对于高于138°C接触过的产品，不能用该测定方法测定.［关键词］9094高效液相色谱纯度测定9094是一种紫外线吸收剂，具有广泛的用途.为了验证建立的9094纯度检测方法的可行性，准确性及耐受性，将从其专属性，系统适应性，精密度，耐受性的方面进行考察.（一） 仪器与试药（二） 方法与结果1测定方法1.1仪器与色谱条件：仪器：液相色谱仪检测器：UV检测器色谱柱：ODS-BP250X4.6mm5Mm柱温：30C波长：274nm流动相：0.1%磷酸：甲醇=25:75进样量：20》l流速：1ml/min溶剂：甲醇1.2溶液配制0.1%磷酸溶液：称取适量磷酸配成0.1%的水溶液，混匀流动相：取过滤的0.1%磷酸溶液250ml,甲醇750ml,混匀，脱气，即得。供试溶液：取样品加溶剂制成约0.4mg/ml的供试品溶液，摇匀，用0.22Pm滤膜滤过。系统适用性试验：在上述色谱条件下，待基线稳定后，连续进样供试溶液5次，理论塔板数按9094主峰计算应不低于3000，9094主峰与相邻杂质峰之间的分离度不得小于1.5，主峰面积的相对标准偏差不得过2.0%。测定：取供试溶液的滤液20M，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，按面积归一化法计算样品的纯度。2方法的专属性验证样品与溶剂分离效果验证1） 供试溶液配制：取9094样品0.0194g,置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，测定时用0.22》m滤膜滤过。2） 测定：按纯度测定条件，分别取供试溶液和溶剂，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。3）测定结果： 溶剂峰保留时间：2.723min产品峰保留时间：23.332min产品峰理论踏板数：13947min产品峰拖尾因子：1.052产品与相邻峰分离度：17.143结论：产品峰与溶剂峰出峰时间没有重叠,分离效果好起始原料与产品分离效果验证1） 供试溶液配制：间苯二酚溶液：取间苯二酚少许，置25ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，测定时用一次性滤头滤过。间苯二酚、9094产品混合溶液：取9094约0.0194g，间苯二酚少许，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，测定时用一次性滤头滤过。2） 测定：按纯度测定条件，分取上述供试溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。间苯二酚单独测定：间苯二酚保留时间：3.182min9094样品和间苯二酚混合测定：9094样品保留时间：22.682min间苯二酚保留时间：3.182min9094与间苯二酚的分离度：33.239min结论：起始原料与产品蜂不重叠.,分离效果好.降解产物与产品分离效果验证2.31高温降解：溶液的制备：条件1：取9094样品0.02011,置常压烘箱200°C加热10分钟，样品熔化。冷却，加少许溶剂溶解，用溶剂转移至50ml量瓶中，并用溶剂稀释至刻度，用0.22Pm滤膜滤过，即得。释至刻度，用0.22Pm滤膜滤过，即得。条件2：取9094样品0.02080g置马福炉138C加热10分钟，样品熔化。冷却，加少许溶剂溶解，用溶剂转移至50ml量瓶中，并用溶剂稀释至刻度，用0.22Mm滤膜滤过，即得。测定：按纯度测定条件，分别取上述供试溶液各20M，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。测定结果：烘箱200C 马福炉138C样品保留时间： 22.058 21.0632降解物保留时间： -- --产品与降解物分离度： -- --结论：样品在烘箱200放置10分钟后熔化,用溶剂溶解进样,主峰为产品峰,但响应值明显变低,样品发生降解,但降解产物在此检测条件下不能检出,样品在马福炉138加热10分钟溶化,用溶剂溶解后进样,产品主峰无明显变化,因此在次温度下,样品未发生降解2.32酸降解溶液的配制：取9094产品O.C5O17g置150ml回流瓶中，加10ml甲醇溶解加浓盐酸溶液5ml,加热约10分钟，放冷，用饱和氢氧化钠溶液调节pH为中性后，样分层，上层为黄色油状物,下层为白色浑浊液，取上层1•牟置10ml量瓶中，力加溶剂容解并稀释至刻度用0.22问滤膜滤过，即得。取下层10ml，加溶剂 ml溶解，溶液为无色澄清液用0.22Pm滤膜滤过，即得。测定：按纯度测定条件，分别取上述供试溶液各20M，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。测定结果：上层 下层样品保留时间： 19.998 19.815降解物保留时间： 一 一产品与降解物分离度： -- --结论：上层油状物主要为产品响应值大小与为进行降解的的样品基本一致,下层浑浊液不溶于溶剂,溶解于水,里面有少量产品,因此样品在酸性条件下未发生降解.(3)碱降解：供试溶液配制：取9094产0.05103g，置150ml回流瓶中，加10ml甲醇溶解，加1.0mol/L氢氧化钠溶液10ml，加热回流10分钟，放冷，用1.0mol/L盐酸10ml溶液调节pH为中性后，取2.5ml置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，用0.22Pm滤膜滤过，即得。测定：按纯度测定条件，取供试溶液各20M，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。测定结果：样品保留时间： 22.298min降解物保留时间： --产品与降解物分离度： --结论：碱降解处理后的样品溶液,主峰为产品峰,响应值正常,只是较小的杂质增多,因此,样品在强碱性条件下未发生降解.专属性验证综合结论：9094有关物质及纯度测定方法,溶剂峰与产品峰,起始原料与产品峰不发生重叠,相邻杂质与产品峰分离度大与1.5,原料与产品峰分离度大与1.5,产品峰拖尾因子小与1.5;产品在强酸强碱条件下不发生降解,在高温条件下发生降解,但降解产物未被检测出,该产品有关物质及纯度测定方法,溶剂峰,起始原料间二苯酚和产品峰分离度满足验证可接受标准,高温降解产物不满足验证可接受标准.3品浓度确认供试溶液配制90940.0194gml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，制得供试溶液1#溶液浓度为0.388mg/ml供试溶液1#1ml，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，制得供试溶液2,溶液浓度为3.88ug/ml供试溶液2#5ml，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，制得供试溶液3，溶液浓度为0.194ug/ml检测限测定：采集噪音2条。并取供试溶液3，注入色谱仪，记录色谱图。12N： 0.067 0.065平均：0.060S： 0.2480.266平均：0.257S/N： 3.89检测限=样品浓度（卩g/ml）X进样量（20UL）=0.194X20X10-3=0.00388ug=3.88ng（2）样品浓度确认：检出限浓度 0.194最低样品浓度= X2= 0.10% =0.388mg/ml0.10％纯度测定方法样品浓度：约0.4mg/m，响应值为满刻度的：50%结论：按照9094纯度测定验证方案测定.检测限为3.88ng,最低样品浓度为0.388mg/ml，纯度测定方法样品浓度符合验证要求.4系统适应性（1） 供试溶液配制：称取9094样品0.0205g，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，用0.22卩m滤膜滤过，即得。（2） 测定：在上述色谱条件下，待基线稳定后取供试溶液连续进样5次，记录色谱图。按9094计算的理论塔板数应不低于3000，主峰与相邻杂质峰之间的分离度应大于1.5，主峰拖尾因子不得过1.5，重复进样主峰峰面积的相对标准偏差不得过2.0%。1#2#3#4#5#理论塔板数： 1350613177131611315913181分离度：16.67714.93826.56619.00528.989拖尾因：1.0501.0451.0441.0441.045主峰峰面积：1530562715264041152581811526388315270289平均峰面积：15272404RSD（％）：0.12结论：按纯度测定方法测定，本仪器系统理论塔板数，分离度，拖尾因子和连续多次进样的重复性符合要求，系统适应性实验满足验证可接受标准.5方法精密度（1）供试溶液配制：称取9094样品约20mg，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，用0.22卩m滤膜滤过，即得。4# 5# 6#1#2# 3#称量（g）：0.020520.02031 0.020700.01942 0.020100.02102（2）测定：系统适应性：在上述（色谱条件下，待基线稳定后取供试品溶液1连续进样5次，按9094峰计算的理论塔板数应不低于1000，主峰与相邻杂质峰之间的分离度应大于1.5，主峰拖尾因子不得过1.5，重复进样主峰峰面积的相对标准偏差不得过2.0%。1# 2# 3# 4# 5#

理论塔板数： 1350613177131611315913181分离度：16.67714.93826.56619.00528.989拖尾因：1.0501.0451.0441.0441.045主峰峰面积：1530562715264041152581811526388315270289符合规定结论（2）方法精密度测定：分取供试品溶液2符合规定结论（2）方法精密度测定：分取供试品溶液2〜6,按面积归一化法计算样品的纯度。分别注入色谱仪，记录色谱图，RSD（％）： 0.121-11-21-31-41-5纯度100%99.99%100%100%100%平均值：100%2-12-23-13-24-14-2纯度：99.99%100%100%99.99%100%100%平均值：100%100%100%5-15-26-16-2纯度：99.99%99.94%100%100%平均值：99.96%100%1#2#3#4#5#每份纯度平均值100%100%100%99.96%100%100%6份纯度平均值：99.99%RSD（%）0.026#结论：6份样品纯度测定的相对标准偏差未超过0.1%,方法的精密读满足验证可接受标准6方法耐用性（1）改变流动相配比配比1：0.1%磷酸溶液：甲醇=30:70溶液的配制：流动相配制•：称取磷酸1ml,加水1000ml,混匀，配成0.1%的磷酸水溶液。取0.1%的磷酸水溶液60ml,甲醇140ml,摇匀，脱气，备用。供试溶液配制：取9094样品0.0198g,置50ml量瓶中,加溶剂溶解并稀释至刻度，用0.22“m滤膜滤过，即得。测定：取供试溶液平行测定两次,记录色谱图,按主峰计算的理论塔板数不得低于3000，主峰与相邻峰的分离度不得低于1.5，主峰的拖尾因子不得大于1.5，与原方法比较，样品纯度的RSD不得过0.1%。1#2#主峰理论塔板数：14622 14625分离度： 5.545 13.626拖尾因子：1.0621.062

主峰峰面积：1405060814046973平均值：14048790RSD：0.02纯度：99.9999.99平均纯度99.99原方法测定纯度100 99.99100100100平均纯度100与原方法的平均值：100RSD：0.007结论：9094纯度测定验证方案方法耐用性改变流动相配比为45:55,因为该比例流动相50min仍未出峰,则取30:70这个比例,主峰在31min左右出峰,取供试液平行测定两次,主峰理论塔板数大于300,分离度大于1.5,拖尾因子小于1.5,与原方法比较,样品纯度RDS小于0.1%,该方法耐用.溶液的配制：配比2：0.1%磷酸溶液：甲醇=20:80(1)流动相配制•：称取磷酸1ml，加水1000ml,混匀，配成0.1%的磷酸水溶液。取0.1%的磷酸水溶液40ml，甲醇160ml，摇匀，脱气，备用。(2)供试溶液配制：取9094样品0.0201g，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，用0.22“m滤膜滤过，即得。测定：取供试溶液平行测定两次，记录色谱图，按主峰计算的理论塔板数不得低于3000，主峰与相邻峰的分离度不得低于1.5，主峰的拖尾因子不得大于1.5，1#2#11032110111.8651.8331.1551.1551418328741483351141833190.000399.9399.92与原方法比较，样品纯度的RSD不得过0.1%。主峰理论塔板数：分离度：拖尾因子：主峰峰面积平均值：RSD：纯度：平均纯度：原方法测定纯度平均纯度：与原方法的平均值：RSD：99.92平均纯度：原方法测定纯度平均纯度：与原方法的平均值：RSD：99.92100 99.99 10010099.960.06100100结论:9094纯度测定方法验证方案，方法耐用性改变流动相配比为35：65，因为35：65比例下50分钟仍未出峰，所以调整另一比例为20：80，主峰出峰时间为12分钟左右，取供试液平行测定2次，理论塔板数大于3000，分离度大于1.5，拖尾因子小于1.5，与原方法样品纯度RSD小于0.1%，该方法耐用。(2)改变流速流速=1.2ml/min溶液的配制：

流动相配制•：称取磷酸1ml，加水1000ml,混匀，配成0.1%的磷酸水溶液。

取0.1%的磷酸水溶液250ml,甲醇750ml,摇匀，脱气，备用。供试溶液配制：取9094样品0.0225g,置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，用0.22》m滤膜滤过，即得。测定：取供试溶液平行测定两次，记录色谱图，按主峰计算的理论塔板数不得低于3000，主峰与相邻峰的分离度不得低于1.5，主峰的拖尾因子不得大于1.5，与原方法比较，样品纯度的RSD不得过0.1%。1#2#主峰理论塔板数：1287912877分离度：1.73812.096拖尾因子：1.0771.077主峰峰面积：1366096213656003平均值：13658482RSD：0.03纯度：100100平均纯度：100原方法测定纯度：100 99.99100100100平均纯度：100与原方法的平均值：100RSD：0结论：按照验证方案测定将流速改变为1.2,供试液主峰理论塔板数大与300,主峰与相邻峰分离度大于1.5,拖尾因子小于1.5,与原方法比较，样品纯度RSD小于0.1％，该方法耐用。溶液的配制：流速=0.8min流动相配制.:称取磷酸1ml,加水1000ml,混匀，配成0.1%的磷酸水溶液。取0.1%的磷酸水溶液250ml,甲醇750ml，摇匀，脱气，备用。供试溶液配制：取9094样品0.0207g,置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，用0.22》m滤膜滤过，即得。测定：取供试溶液平行测定两次，记录色谱图，按主峰计算的理论塔板数不得低于3000，主峰与相邻峰的分离度不得低于1.5，主峰的拖尾因子不得大于1.5，与原方法比较，样品纯度的RSD不得过0.1%。1#2#主峰理论塔板数：1495614949分离度：20.59914.523拖尾因子：1.0621.061主峰峰面积：1846520218433532平均值：18449367RSD：0.12纯度：99.9299.99平均纯度： 99.96

平均纯度：100与原方法的平均值：99.98RSD：0.03原方法测定纯度：10099.99100100100结论：按照9094纯度测定方法验证方案，调整流速为0.8mg/ml取供10099.99100100100试液平行测定2次，记录色谱图主峰理论塔板数大于3000，分离度大于1.5，拖尾因子小于1.5，与原方