EGFP在肿瘤细胞中的表达分析 PC

EGFP在肿瘤细胞中的表达分析彭超222008371042030

西南大学生命科学学院，重庆400715摘要：肿瘤基因靶向治疗已经成为目前肿瘤治疗研究最活跃的领域之一，其目的是在不损伤正常细胞的前提下，进行选择性杀伤或抑制肿瘤细胞。目前已有大量靶分子被分离和鉴定，如端粒酶、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶等，其中端粒酶是目前所发现的恶性肿瘤最广谱的分子标记，在绝大多数恶性肿瘤中被激活，而在正常体细胞中一般为阴性表达。近年来研究人员利用人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)基因在端粒酶阳性肿瘤细胞中高效表达的特点，构建用hTERT启动子调控其它抗肿瘤基因的表达载体，靶向破坏肿瘤细胞已取得了较大进展。由于慢病毒载体具有可感染细胞并整合DNA序列的、可转移较大的基因片段等优点。本研究通过构建由hTERT基因启动子介导绿色荧光蛋白基因表达的慢病毒载体,并转染肿瘤细胞,检测该启动子在端粒酶阳性的肿瘤细胞中eGFP的表达情况。关键词：eGFPhTERT肿瘤 TOPO克隆 脂质体介导法第一部分文献综述靶向诱导肿瘤细胞凋亡近年来研究发现，肿瘤的形成与凋亡功能的失调密切相关，提出肿瘤的发生可能是肿瘤细胞异常增殖和其凋亡调控功能受到抑制共同作用的结果。一些研究人员利用hTERT启动子的肿瘤特异性，在其下游连接凋亡相关的抑癌基因或细胞因子，导入端粒酶阳性的肿瘤细胞，从而靶向诱导肿瘤细胞发生凋亡，已取得良好效果［7］。Caspases是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，在细胞的凋亡过程中发挥重要作用，其中Caspase-3是细胞凋亡的执行者。Yang等［8］利用构建的hTERT/re-Caspase-3系统，同时转染端粒酶阳性的鼻咽癌细胞CNE1、结肠癌细胞HRT-18、胃癌细胞MGC和端粒酶阴性的正常上皮细胞Hacat，孵育48h后，荧光显微镜下观察，肿瘤细胞呈典型的核固缩、核碎裂、核溶解的凋亡形态；流式细胞仪分析显示，三种端粒酶阳性的肿瘤细胞(CNE1、HRT-18和MGC)凋亡率为15%~20%，而端粒酶阴性的Hacat仅为1.5%~3.5%；动物试验将hTERT/re-Caspase-3直接注射在裸鼠肿瘤内，以不含Caspase-3的hTERT/SEAP为对照，连续7d后观察发现，hTERT/re-Caspase-3能显著抑制裸鼠肿瘤的生长，证实了hTERT/re-Caspase-3的体内外靶向抗肿瘤作用。Jacob等［9］构建的hTERT基因启动子驱动的促凋亡基因TRAIL的表达载体，也同样证实了其可靶向性诱导端粒酶阳性的胰腺癌和结肠癌细胞发生凋亡。靶向介导自杀基因抑瘤作用自杀基因又称前药敏感基因，将自杀基因导入肿瘤细胞，可将无毒性药物前体在肿瘤细胞内代谢为毒性产物，进而杀伤肿瘤细胞。常见的自杀基因包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)基因、细胞色素P450基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因、大肠杆菌硝基还原酶(NTR)基因等，其中TK和CD研究最多。体内外实验证实［10］,利用肿瘤特异性hTERT启动子介导自杀基因转染肿瘤细胞，不仅能靶向杀死被转染的肿瘤细胞，还可通过旁观者效应杀死周围未被转染的肿瘤细胞，以及远处扩散转移的肿瘤细胞也有凋亡现象。TK可将无毒性的前体药物更昔洛韦(ganciclovir，GCV)磷酸化为三磷酸更昔洛韦(GCV-TP)，抑制细胞DNA聚合酶，从而阻断核酸代谢途径，导致细胞死亡。Tang等［11］构建hTERT启动子调控HSV-TK基因的表达质粒(pGL3-hTp-tk),以pGL3-sv40-tk为对照，同时转染端粒酶阳性的肺癌细胞A549和端粒酶阴性的正常成纤维细胞MRC-5，发现用GCV处理后，pGL3-sv40-tk同时抑制A549细胞和MRC-5细胞的生长，而pGL3-hTp-tk仅对A549细胞有抑制作用，对MRC-5细胞无影响ONTR可将CB1954 单功能烷基化合物转化为剧烈的双功能烷基化合物，进而引起DNA交联。Bilsland等［12］构建hTERT启动子调控NTR基因的载体，转染宫颈癌、卵巢癌等七种肿瘤细胞和四种正常细胞，Westernblot分析其仅在肿瘤细胞中表达，且使肿瘤细胞对CB1954的敏感性增加18倍，而正常细胞却不受影响。近年双自杀基因联合治疗逐渐成为研究热点，Kong等［13］构建hTERT启动子调控下的双自杀基因(CD-TK融合基因)表达载体，以hTERT-TK作对照，转染卵巢癌细胞3A0、正常卵巢上皮细胞和人胚肺成纤维细胞，结果显示与单纯hTERT-TK/GCV系统相比，联合CD-TK/5-FC+GCV双自杀基因系统对端粒酶阳性的3AO细胞的杀伤作用显著增强，而对端粒酶阴性的正常卵巢上皮细胞和人胚肺成纤维细胞则无杀伤作用。动物实验也证实了CD-TK融合基因明显的肿瘤抑制作用。端粒酶和hTERT启动子端粒是真核生物线性染色体末端的特殊结构，由TTAGGG重复DNA序列和端粒结合蛋白构成。端粒酶是位于细胞核内依赖于RNA的逆转录DNA聚合酶，主要功能是合成重复核苷酸序列并将其添加至染色体末端以维持端粒长度，使细胞无限增殖，细胞因此获得永生化，而永生化是细胞癌变的实质。维持端粒酶活性的必需集团有两个：一是组成性表达的人端粒酶RNA组分(humantelomeraseRNA，hTR)，二是人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)ohTR基因在所有细胞均有表达，而hTERT基因仅在大多数肿瘤和永生化细胞系中高表达，在成熟分化的正常体细胞中其表达处于关闭状态，因此端粒酶基因特异地转录并表达于多数肿瘤细胞中，而在正常组织细胞中检测不到端粒酶的活性形式。hTERT作为端粒酶活性的主要调控亚单位，它的表达与端粒酶活性呈正相关。hTERT基因被克隆出后，日益引起学者重视，已证实hTERT与肿瘤的关系最为密切，其在转录水平调控端粒酶的激活与表达，是决定端粒酶活性的重要因子［4］，而hTERT高表达的直接原因是由于其启动子在肿瘤细胞内完全开启，因此hTERT启动子是肿瘤特异性启动子，是控制肿瘤细胞恶性程度的开关。它的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显高于阴性细胞，研究表明利用端粒酶hTERT启动子靶向基因治疗可选择性地杀死端粒酶阳性的肿瘤细胞，而对端粒酶阴性的正常细胞则无影响。目前国内外学者已经普遍认为，hTERT启动子是一新型的、具有肿瘤选择性的启动子，是理想的肿瘤基因治疗的靶点。端粒酶与肿瘤诊断自从1994年，Kim开始应用一种基于PCR的灵敏的端粒酶检测方法TRAP来探测人体组织中的端粒酶活性后［8］,Shay等［9］总结了各种恶性肿瘤组织、癌旁组织、癌前组织及良性肿瘤组织中的端粒酶活性,发现90%的恶性肿瘤组织的端粒酶活性呈阳性,而癌旁组织的阳性率只有6%,良性肿瘤和癌前组织的阳性率为14%,在正常组织中,除少数种类外,其阳性率均为0,可见端粒酶活性是恶性肿瘤的一种标志，其作为肿瘤标志广泛性和明确性要优于Ki267和MIB1。因此，端粒酶检测，特别是精确定量将有助于肿瘤良恶性的判断。实施定量PCR技术、细针抽吸等方法与传统的TRAP相结合检测端粒酶，其结果在灵敏度与特异度方面更加可靠，使得利用端粒酶对肿瘤进行诊断或分期的可行性提高。然而，端粒酶作为肿瘤诊断的标志物也有一定的局限性。由于人体的生殖细胞、再生细胞也有一定的端粒酶表达;约20%的肿瘤不表达端粒酶，正常鼻咽黏膜中端粒酶可呈阳性，故不宜用于鼻咽原位癌诊断［10］;所以利用端粒酶作为肿瘤的诊断乃至治疗靶点还有待进一步商榷。第二部分正文引言：为了构建由人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控eGFP报告基因的慢病毒载体，观察eGFP在肿瘤细胞中的表达情况。我们将用TOP0克隆的方法将eGFP序列转至UpLenti6/V5D-Top质粒上；再用hTERT基因启动子取代慢病毒载体eGFP上游的CMV启动子；将重组慢病毒质粒用脂质体介导法转入端粒酶阳性的人肿瘤细胞中进行功能鉴定。使端粒酶阳性的癌细胞中可以观测至绿色荧光蛋白表达。1材料与方法：1.1.1主要材料质粒：pEGFP-Nl质粒、pLenti6/V5D-Top质粒]*0d^ciMinpLenti6/V5-1D-TOPO@6964]*0d^ciMinpLenti6/V5-1D-TOPO@6964bpXNSsV5epitopei囲fpiTTCCOG细胞：E.coliDH5a菌株、Hela细胞酶：BspDI、AgeI、BamHI内切酶、T4连接酶、Taq酶其他：胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、阳离子脂质体N-[l-2,3-Dioleyoxy,Propyl]-n,n，n-TrimethylammoniumChloride（DOTMA）和Dioleoylphotidye-thanolamine（DOPE）、1.1.2技术路线基本表达EGFP质粒更换启动子或其它调控元件条件性表达EGFP质粒阳离子脂质体肿瘤细胞或细胞株条件性表达EGFP质粒阳离子脂质体肿瘤细胞或细胞株质粒DNA+脂质体复合物转EGFP基因细胞j-—加入调控因子荧光显微镜观察EGFP表达1.2方法EGFP基因的扩增设计扩增EGFP基因的引物,上游引物:5'-CACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3'下游弓I物:5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA3'上游引物含有促进目的基因在真核细胞表达的Kozak序列CACC,下游引物设计与TOPO克隆载体的V5标签融合，能形成融合蛋白。以pEGFP-Nl质粒为模板扩增EGFP基因,PCR反应操作为：1）在50ul反应体系中分别加入：MiniQH2O210XPCRbuffer37.5ul5ul25mM MgCl23ul10mM dNTPmix1ul引物1（10》M）1ul引物2（10》M）1ulTaq(2to5units/ul)0.5ul

模板(DNA)模板(DNA)终体积为2)短暂离心混匀后94°C94C62C72C30-35个循环72C4C50ul放入PCR仪中，反应程序如下：5min（时间根据模板来确定）45S45S（退火温度和时间根据引物来确定）lmin（时间根据扩增片段长度来确定）（循环次数根据扩增目的来确定）7-10min保存（一般不保存，保存对PCR仪损坏大）反应完成后，将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果。切下含目的片段的琼脂块，用于DNA片段回收。pLenti6V5D-TOPO-EGFP质粒构建1•将PCR产物低熔点琼脂糖（1%）电泳，紫外灯下切胶，放入离心管，65C水浴,至胶融化;将离心管移至37C培养箱中，加4uL融化的胶入TOPO克隆反应液20uL（内含plenti6/V5D-TOPO线形的定向TOPO克隆慢病毒载体）；3.37C孵育TOPO克隆5min-10min,使胶融化，将2uL-4uL反应液加入200uLE.coliDH5a感受态细胞，轻轻混匀；置冰上5min-30min；42C30s，勿摇；迅速置冰上；加入250uLSOC培养基；37C慢摇孵育1h;涂板，LB培养基（含50ug/mL-100ug/mLampicillin和50ug/mLblasti-cidin）过夜，筛选阳性克隆。pLenti6V5D-TOPO-EGFP质粒的提取挑单菌落邙日性克隆）接种于LB（含相应抗生素）液体培养基中，培养（37C,200rpm）8h,再将此活化的菌液取400ul于20ml含相应抗生素的液体培养基中（1/50），250rpm， 37C培养2h,即可获得经扩大培养的菌液；柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加A500pl的平衡液BL,12,000rpm（~13,400Xg）离心分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）取1-2ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm（~13,400Xg）离心1分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。向留有菌体沉淀的离心管中加入250pl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。向离心管中加入250pl溶液P2，温和地上下翻转6—8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组NA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。向离心管中加入350pl溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm（~13,400Xg）离心0分钟，此时在离心管底部形成沉淀。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm（~13,400Xg）离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱SP3放入收集管中。可选步骤：向吸附柱CP3中加入500卩l去蛋白液PD,12,000rpm（~13,400Xg）离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。hTERT启动子片段依据NCBI人pEGFP—N3基因编码区全长序列，自行设计针对人EGFP基因编码区全长序列两端的引物（含BamHI和BspDI酶切位点），并委托上海Invitrogen公司合成。其引物序列为设计扩增hTERT启动子的引物，上游引物：5’-TAAACTAGTAATGTCGAATAACGC-3下游引物：5’-TATCTCGAGGAATGAATCACGGTAG-3Primer片段的回收纯化第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在15ml漂洗液PW中加入60ml无水乙醇!所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500pl平衡液BL，12,000rpm（~13,400Xg）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。3•向胶块中加入3倍体积溶胶液PN；当回收的目的片段＜150bp或琼脂糖凝胶浓度＞2%时，建议使用6倍体积溶胶液PN（如凝胶重为0.1g,其体积可视为100pl,依此类推）。50°C水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2分钟，12,000rpm（~13,400Xg）离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。注意：吸附柱容积为800pl，若样品体积大于800pl可分批加入。向吸附柱CA2中加入700pl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400Xg）离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5分钟再离心。向吸附柱CA2中加入500pl漂洗液PW，12,000rpm（~13,400Xg）离心30-60秒，倒掉废液。将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm（~13,400Xg）离心2分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验8．将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB,(如果回收的目的片段＞10kb,则洗脱缓冲液EB应置于65-70°C水浴预热)，室温放置2分钟°12,000rpm(~13,400Xg)离心2分钟收集DNA溶液。1.2.6hTERT取代pLenti6V5D-TOPO-EGFP质粒上的CMV启动子用BspDI、BamHI内切酶内切hTERT启动子PCR片段和pLenti6V5D-TOPO-EGFP质粒。提纯后，将回收片段至于一1.5mlEP管中，加入T4连接酶，22C连接16h。分离纯化重组后的质粒。1.2.7Hela细胞的培养解冻操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。将新鲜培养基置于37C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。取出冷冻管，立即放入37C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10〜1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1m1解冻细胞悬浮液作存活测试。细胞复苏取6ml培养基于离心管将融化的冻存细胞悬液加入离心管离心1200rpm，6min，去上清加3ml培养基重悬细胞移入培养瓶，加血清，塞上胶塞贴好标签，倒置显微镜上观察并记录，放入培养箱。细胞换液倒掉旧培养液，先加入3ml培养基，再加入0.3ml血清细胞冻存或传代将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收集，以冻存液重悬细胞至终浓度约106/ml。以每管1〜2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。1.2.8脂质体介导法转染Hela细胞细胞培养:取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2X105个细胞培养液，37°CC0培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 2转染液制备:在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10MgDNA，终量100》L,B液：用不含血清培养基稀释2-50》gLR，终量100》L,轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。3•转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。4•转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37C温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。1.2.9表达产物检测将培养瓶至于倒置荧光显微镜下，用紫外线照射观察。并记录结果。参考文献【1】｛余松涛,杨应斌,史春梦,陈陵,汤旭东,黎川,师红磊,李长珠,李宁,王国珍,吴玉云,房殿春，杨仕明.端粒酶hTERT亚单位启动子靶向性慢病毒对肿瘤活体实时显像的实验研究[J].实用临床医药杂志,4-12.【2】张景泽，杨智勇，丁鹏•端端粒酶抑制剂用于肿瘤治疗的研究新进展[J].中国老年学杂志，2009，29：903-904.【3】李淑慧，余忠华•人端粒酶RNA基因与肿瘤的相