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文档简介

微生物快速检测法（DME）1、原理细菌和酵母菌都能在染色后通过显微镜直接计数，本程序可以对淀粉糊浆中活菌/死菌微生物污染进行准确计数2、仪器及试剂1、显微镜，40X物镜下观察2、天平3、微波炉4、三联不锈钢过滤器（包括三联支架+真空泵）5、平口镊子6、0.8um/25mm过滤膜7、载玻片8、盖玻片9、异丙醇，100%10、吖啶橙染色剂11、浸油12、75%乙醇13、洗洁精14、无菌杯3、操作程序1取一洁净的无菌杯（可重复使用，用洗洁精加自来水清洗干净后，使用离子水冲洗至少三次）2称取样品（取13克加去离子水至103克）3使用微波炉将配置好的样品微热（使样品充分溶解）4用去离子水将三联过滤杯冲洗干净。（开过滤器，开泵一关过滤器，关泵—开排气阀，排气抽真空）（注：后可加入75%乙醇5ml，放置1min后滤掉）5使用平口镊子放置滤膜，亮面朝上，滤膜与过滤砂芯中间无缝隙6取出热好的样品，过滤，至103克样品全部滤完7关过滤器，关泵，排气8加入2.5ml吖啶橙染色剂，使其溢满整个滤膜9染色一分钟后，关排气阀，开过滤器，开泵10使用异丙醇冲洗（至少2.0ml）11在等待染色的lmin时，取一载玻片加一滴浸油12在泵开启的状态下，用镊子移下滤膜（有助于滤膜干燥，便于观察）13在滤膜上再加一滴浸油，盖上盖玻片并用镊子将盖玻片压实（便于观察）14将放好滤膜的载玻片放在显微镜的40倍物镜下观察15细菌和酵母菌呈现桔色或绿色（细菌为针尖大小的亮点，酵母菌呈有规则的圆形或椭圆形，多为两个呈三个连在一起）16取中间位置观察20个视野，菌落总数/ml为20个视野的平均值*8617观察时，应注意滤膜四周的细菌，最好每个角落能观察到注意：1每个检测过程都在通风橱中进行2此检测方法检测出的菌类为死菌和活菌的总数4、技术程序可以采用集中计算方法确定每毫升的菌数，需要确定显微镜的视野范围，这个面积就是显微镜在给定放大倍数内可观察到的视野范围的总面积。4.1在400倍放大显微镜下，测定视野直径。4.2测得直径后，视野面积便可由下式计算：视野面积=（直径/2）2*3.144.3下一步是计算滤膜的面积。尽管滤器的直径是25mm，但过滤使用的不是滤器的总面积。有水和一滴染色剂结合的50ml样品应该被过滤。可以测量染色剂存留的滤器的面积，滤器直径一旦被测量，滤器面积视野数量按下式计算：视野数/ml=（滤器面积/视野面积）/样品的毫升数至少应该计数20个视野，然后取视野平均值，计算每毫升的菌数按下式计算：菌数/ml=（每毫升的平均菌数）*（视野数/ml）5注意事项5.1样品量为130克5.2快速检测：可以使用20X的物镜快速检查存在的酵母菌和霉菌。5.3视野的报告：如果钱10个视野计算出每毫升计数大于2000，则这10个视野就足以报告此

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