生物信息学-第4次理论蛋白质组学

蛋白质组学背景基因数量有限性和基因结构的相对稳定性VS生命现象的复杂性和多变性从genomic到proteome对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务。Theeraof‘omics’-basedscienceGenomics（基因组学）Post-genomicscience（后基因组时代）Functionalgenomics（功能基因组学）Transcriptomics（转录组学）Proteomics（蛋白质组学）Metabolomics（代谢组学）Structuralgenomics（结构基因组学）Aim-3Dstructuresofallproteinfolds!

第一节蛋白质组学的概念及发展进展第二节蛋白质组表达模式的研究方法第三节蛋白质组功能模式的研究方法

主要内容

第一节蛋白质组学的概念及发展进展

蛋白质组（proteome）：PROTEins+genOME，意思是Proteinsexpressedbyagenome（基因组表达的所有蛋白质）。1994年由Williams和Wilkins提出，是一个动态的概念，指的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质。蛋白质组和蛋白质组学的概念对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组：蛋白质组学(proteomics)

指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。

主要研究内容

了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；

明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；

描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。

表达蛋白组学ThestudyofglobalchangesinproteinexpressionProteomics蛋白质组功能模式

Thesystematicstudyofprotein-proteininteractionsthroughtheisolationofproteincomplexes蛋白质组研究包括两个方面：

基因组转录组蛋白组ThestudyofproteinsexpressedbygenomesCompletionofthesequencingofthe1stdraftofhumangenomeindicatesthereareapproximately250,000proteinsinthehumangenomeOnly2-5%ofproteinsinhumangenomehavebeenidentified功能蛋白质组学

(functionalproteomics)的提出

功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。

从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱。发展进展各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF）

美国国立癌症研究院（NCI）投资1000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。

Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。

1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议

1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议

1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议

我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会

2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。

科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。第二节蛋白质组表达模式的研究方法研究蛋白质组组成成分、差异和功能主要研究目标（一）蛋白质组研究中的样品制备

通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。样品预分级的主要方法蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等

样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。组织水平上的蛋白质组样品制备

临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)

可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。

（二）蛋白质组研究中的样品分离双向凝胶电泳two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。特点可分离10～100kD分子量的蛋白质高灵敏度和高分辨率便于计算机进行图像分析处理与质谱分析匹配2-DE技术的缺点

极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。

胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。新型非凝胶技术

液相色谱法liquidchromatography，LC毛细管电泳capillaryelectrophoresis，CE

（三）常见蛋白质显色技术

考马斯亮蓝染色

常见显色方法比较考染和银染的比较有机染料和银染考染灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为8~10ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。负染能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。速度快（5~15min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。该技术主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用。胶体扩散染料主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似。这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。有机荧光团染料包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等荧光染料。这三种染料可对SDS胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成，灵敏度为2~10ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。金属螯合染料这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合。其中SYPRORuby也是一种基于钌的金属发光染料。（四）凝胶的图像处理分析和胶内酶切凝胶图像的扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库的建立：目前有多种图像分析软件可用于胶的图像分析:

MelanieII(BioRad),PDQuest(BioRad),Phoretix2DFull,(AmershamPharmaciaBiotech)ImageMaster2dPlatinum这些软件可以完成蛋白质点的识别、匹配等，具有很强的分析功能，但其缺点是需要很多的图像手工校对，正常肝细胞和肝癌细胞的蛋白质组双向电泳差异表达谱园点标记的点为两者的差异蛋白数字号码为蛋白质点在参考胶中的索引号蛋白质的胶内酶切

包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程（五）质谱分析样品分子离子化后，根据不同离子间质核比（m/z）的差异来分离并确定分子量定性定量质谱m/z离子化原理质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。20世纪初20世纪40年代20世纪60年代20世纪80年代J.J.Thomson制成第一台质谱仪主要是用来进行同位素测定和无机元素分析开始用于有机物分析出现了气相色谱-质谱联用仪成为有机物分析的重要仪器质谱新技术：电喷雾电离源，大气压化学电离源液相色谱-质谱联用仪感应耦合等离子体质谱仪质谱技术发展过程SirJosephJohnThomson-1906年诺贝尔物理奖

主要贡献：气态下离子导电的理论和实验探索

FrederickSoddy-1921年诺贝尔化学奖

主要贡献：使我们对放射活性物质的认识大大提高，另外他对同位素的起源和性质也作了出色工作。

FrancisWilliamAston-1922年诺贝尔化学奖

主要贡献：使用质谱方法大规模的研究非放射性元素的同位素；提出整数规则。

HansG.DehmeltandWolfgangPaul-1989年同获诺贝尔物理奖

主要贡献：开发了离子阱质谱技术。

RobertF.CurlJr.&SirHaroldW.Kroto&RichardE.Smalley-1996年分享诺贝尔化学奖

主要贡献：使用质谱发现富洛伦尼斯（C60-C80，足球烯）

JohnFennandKoichiTanakawithKurtWuthrich-2002年分享诺贝尔化学奖

主要贡献：发展了可用于分析生物大分子的软电离方法。质谱相关工作的成就进样系统离子源质量分析器检测器数据采集及分析真空系统质谱仪模块组成真空系统

质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特点，我们用液质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。在不破坏真空度的情况下，使样品进入离子源。气体可通过储气器进入离子源。易挥发的液体，在进样系统内汽化后进入离子源。难挥发的液体或固体样品，通过探针直接插入离子源。进样系统分子失去电子，生成带正电荷的分子离子

分子离子可进一步裂解，生成质量更小的碎片离子

M+eM+.+2eM-.

小于1%M+.A+.++B+CD++.

中性分子或碎片R.50-70eV离子源离子源（Ionsource）质谱仪的离子源种类主要有：化学电离源(ChemicalIonization,CI)快原子轰击源（FastAtomicbombardment,FAB）

电喷雾源(ElectronsprayIonization，ESI)大气压化学电离源(AtmosphericpressurechemicalIonization,APCI)大气压光学电离源（Atmosphericpressurephotoionization,APPI）基质辅助的激光解吸电离源（MALDI-TOF）电子电离源(ElectronIonizationEI)

每一种电离方法都有一定的分子量检测范围

EI/CIESI/FABAPPIAPCIMW100,00010,000100010010PolarityVeryPolarNonpolar电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于80年代末期的两项轨电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，并得到迅速的发展。被称做是“软”电离技术，因为：他们在离子化过程中不会破坏分子结构，能实现分子量大于10,000质量单位的生物大分子的质量分析电喷雾源(ESI)待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口。在喷口高电压作用下形成带电荷的微滴，随着微滴中的挥发性溶剂蒸发，微滴表面的电场随半径减少而增加，到达某一临界点时，样品将以离子方式从液滴表面蒸发，进入气相。这一过程即实现了样品的离子化，没有直接的外界能量作用于分子，因此对分子结构破坏较少，是一种典型的“软电离”方式。其他特点

可形成多电荷离子，因此在较小的m/z范围内可以检测到大分子质量的分子。采用电喷雾质谱目前可测定分子质量100kDa以下的蛋白质，最高可达150kDa。由于离子蒸发使电喷雾质谱采用液相方式进样，因此可与蛋白质化学中常用的液相色谱联用，即液相色谱-电喷雾质谱(LC-ESIMS)，蛋白质或多肽经过高效液相色谱分离后，直接进入质谱进行分子质量测定。在常规电喷雾质谱中，喷雾的过程易形成较大液滴，液滴中的样品分子在离子源就不能完全离子化，从而降低了样品的利用率和灵敏度。基质辅助激光解析电离是利用固体基质分子均匀的包埋样品分子，在激光的照射下，基质分子吸收激光能量而蒸发，携带样品分子进入气相，进一步将能量传递给样品分子，从而实现样品分子离子化。由于样品的电离过程是由基质介导的，因此基质的选择对分子离子化有很大的影响,继而影响到分析的灵敏度、分辨率和精确度。合适的基质应该是保证待测物的离子化，而且基质本身的离子造成的背景较弱。MALDI最大的特点是离子电荷通常为1-2个，而不象ESI中为多电荷离子，对分子质量较大的样品而言，不会形成复杂的多电荷图谱，因而对图谱的解析比较清楚。质量分析器(Massanalyzer)

是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。种类：磁式单聚焦分析器磁式双聚焦分析器四极杆分析器离子阱分析器飞行时间分析器回旋共振分析器串接/联用……飞行时间分析器

（TimeofFlightMS,TOF-MS）

TOF-MS的核心部分是一个无场的离子漂移管

加速后的离子具有相同的动能

m/z小的离子，漂移运动的速度快，最先通过漂移管，到达检测器。

m/z大的离子，漂移运动的速度慢，最后通过漂移管，到达检测器。

检测通过漂移管的时间(t)及其相应的信号强度，可得到质谱图，t为或s数量级。

适合于生物大分子，灵敏度高，扫描速度快，结构简单，分辨率随m/z的增大而降低。飞行时间质量分析器检测器接收离子束流的装置，有：电子倍增器、光电倍增器、微通道板横坐标为离子的质核比，纵坐标为离子相对强度或相对丰度。乙醇的如下：质谱图InletIonizationMassAnalyzerMassSorting(filtering)IonDetectorDetectionIonSource• Solid• Liquid• VaporDetectionsFormions(chargedmolecules)SortIonsbyMass(m/z)1330134013501007550250MassSpectrum总结：获得质谱流程（六）蛋白质序列测定主要有两种方法：数据库搜索(Sequencedatabasesearch):

从头算法(Denovointerpretation)两种方法各自的特点数据库搜索算法将实验质谱与由数据库中的肽序列得到的理论质谱相关联,得到候选肽序列,它对质谱质量要求不高,能够鉴定复杂的蛋白质样品,前提是待鉴定蛋白质样品的序列存在于数据库中.从头算法利用实验质谱中谱峰之间的质量差直接计算出肽序列,不需要数据库的辅助,能够鉴定数据库中不存在的新序列,但是它需要相对高质量的质谱数据数据库搜索原理1、根据蛋白质被酶解的特异性位点(如胰蛋白酶在氨基酸K和R的C端切断蛋白质链)、遗漏位点数(肽段上没有被切断的特异性位点数)等参数模拟酶解从数据库中读出的蛋白质序列,形成理论肽;2、根据质谱仪种类、肽的理化性质、翻译后修饰等参数模拟肽在质谱仪中碎裂的模式对每个理论肽进行碎裂,生成理论碎片离子,每个理论肽对应的所有碎片离子的质荷比及其预测强度构成理论串联质谱；

3、将理论串联质谱与实验串联质谱用某种评价体系(打分方法)相关联,得到候选肽的列表；4、最后对候选肽进行验证和分组就将可能的蛋白质鉴定出来.这种方法的核心是肽鉴定打分算法和理论串联质谱的预测模型。一些典型的打分算法基于概率的打分算法

Mascot、SCOPE、ProbID、OLAV采用基于概率的肽打分算法.Mascot通过考虑肽长度、遗漏酶切位点、离子质荷比误差以及离子强度等因素,计算实验串联质谱与理论串联质谱间的匹配作为一次随机事件的发生概率P,

对这些得分进行显著性评价得到最终的肽鉴定结果.这种评价方法的不足在于显著性的高低与数据库大小相关,不具客观性.SCOPE和ProbID都是利用贝叶斯定理计算候选肽生成实验串联质谱的后验概率.OLAV则基于贝叶斯定理利用信号检测理论中的对数似然比来分辨真假匹配.基于谱向量点积(spectraldotproduct)的打分算法瑞士的SWISS-PROT数据库拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础MascotSearchEngineMascotMS/MSIonsSearch第三节蛋白质组功能模式的研究方法揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。

主要研究目标

（一）蛋白质翻译后修饰的研究翻译后修饰糖基化乙酰化甲基化羧基化二硫键（二）蛋白质相互作用研究技术生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现细胞信号转导及病原体感染和免疫反应1989年Field和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。1．酵母双杂交系统（yeasttwo-hybridsystem）

转录激活因子GAL4的特点N端含NLS和与酵母GAL1基因启动子上游激活序列(UASG)结合的结构域C端含GAL1转录激活结构域功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性系统构建分别构建含GAL4BD和AD的两个酵母融合蛋白表达载体；建立含特殊基因型、适用于双杂交体分析的酵母菌株

酵母双杂交技术的基本原理主要特点和优势使蛋白质表现型和基因型相联系筛选cDNA文库真实反应体内蛋白质间相互作用情况不需分离靶蛋白敏感性高缺点1.假阳性结果2.假阳性结果3.限于核内表达的蛋白质的相互作用

2．基于质谱的蛋白质相互作用研究方法靶蛋白制备

蛋白质复合体的纯化

蛋白质复合体的质谱鉴定基本步骤：（1）亲和层析耦联质谱技术

基本原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶蛋白的结合蛋白。

先决条件得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作为诱饵（bait）获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用的蛋白质主要优点

灵敏度高：高浓度靶蛋白候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等

检测多亚基蛋白质之间的相互作用

（2）免疫共沉淀耦联质谱技术