第02章氨基酸与蛋白质一级结构

生物化学第一章氨基酸的结构蛋白质蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。Protein

总而言之，一切重要的生理活动都离不开蛋白质，蛋白质是生命现象的最基本的物质基础。

几年前，在欧洲乃至全世界引起恐慌的疯牛病，其致病元凶就是蛋白粒子（prion），这种只有蛋白质而没有核酸的病原体，可引起人或动物的疯牛病，这一发现又一次说明了蛋白质是生命的物质基础。2023/1/23蛋白质的重要作用

蛋白质作为生命现象的物质基础之一，构成一切细胞和组织结构的最重要的组成成分，参与生物体内许多方面的重要功能。（一）酶的催化作用（二）转运和贮存功能（三）运动功能（四）结构支持作用（五）免疫作用（六）生物膜功能（七）接受和传递信息（八）代谢调节功能（九）控制生长和分化（十）感染和毒性作用章首蛋白质的元素组成蛋白质是一类含氮有机化合物：碳、氢、氧、氮外，还有少量的硫。某些蛋白质还含有其他元素；磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳50％氢7％氧23％氮16%硫0—3％其他微量章首

氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量

★蛋白质含量的测定：凯氏定氮法

(测定氮的经典方法)

优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；缺点：易将无机氮(如核酸中的氮)

都归入蛋白质中,不精确。一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g蛋白质；故：※蛋白质含量=氮的量×100/16×6.25

第一节

氨基酸－蛋白质的基本单位一．蛋白质的水解蛋白质可以被酸、碱或蛋白酶催化水解，蛋白质的水解分完全水解和部分水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解。章首构成蛋白质的20种氨基酸

除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。二、氨基酸的结构和分类

20种氨基酸都被称之

-氨基酸，因为

-氨基酸分子中的

-碳（分子中第2个碳，Ca）结合着一个氨基和一个酸性的羧基，此外

-碳还结合着一个H原子和一个侧链基团（用R表示）。每一种氨基酸的R都是不同的，侧链上的碳依次按字母命名为ß,,和碳，分别指的是第3、4和5位碳各种氨基酸的区别在于侧链R基的不同。-氨基酸可变部分不变部分Aminoacid二十种常见蛋白质氨基酸的分类据营养学分类

必需ＡＡ８种非必需ＡＡ12种据R基团化学结构分类

脂肪族ＡA（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)杂环ＡＡ(His、Pro)据R基团极性分类极性R基团AA非极性R基团AA（８种）不带电荷（７种）带电荷：正电荷（３种）负电荷（２种）非极性R基团氨基酸不带电荷极性R基团氨基酸带电荷R基团氨基酸二十种常见蛋白质氨基酸的分类据R基团化学结构分类

脂肪族ＡA（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)杂环ＡＡ(His、Pro)甘氨酸（Gly,G）丙氨酸（Ala,A）缬氨酸（Val,V）亮氨酸（Leu,L）异亮氨酸（Ile,I）中性脂肪族氨基酸含羟基或硫脂肪族氨基酸丝氨酸（Ser,S）苏氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺（Gln,Q）碱性氨基酸赖氨酸（Lys,K）精氨酸（Arg,R）组氨酸（His,H）杂环杂环氨基酸组氨酸（His,H）脯氨酸（Pro,P）芳香族氨基酸

苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Trp,W）按营养价值分类：

必需AA：人和哺乳动物不可缺少但又不能合成的来自食物，8种Leu、Lys、Met、Phe、Ile、Trp、Thr、Val

半必需AA：虽能合成，但速度太慢。Arg、His非必需AA：剩余AA

婴儿时期所需:精氨酸(Arg)、组氨酸(His)早产儿所需：色氨酸(Try)、半胱氨酸(Cys)章首几种重要的不常见氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。章首非蛋白质AA除蛋白质AA外，还有200多种非蛋白质AA，α-，β-，γ-氨基酸，还有D-AA（α-AA）常参与微生物细胞壁的构成，D-AA也是天然抗菌肽的组成成分。β-丙氨酸是偏多酸（维生素）的一个组分γ-氨基丁酸—神经递质（谷氨酸脱羧形成）D-苯丙氨酸是短杆菌肽S的结构成分D-缬氨酸是放线菌素D的结构成分章首三．α-氨基酸的构型与旋光性蛋白质水解的常见氨基酸只有20多种，除Gly全为L-AA，它们是与甘油醛或乳酸相比较而决定的。凡是与L－甘油醛（或L－乳酸）构型相同的，就定义为L－氨基酸，反之为D－氨基酸。构成蛋白质的氨基酸均为L－氨基酸。章首氨基酸的旋光性-光学活性除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。章首

不对称碳原子：指与四个不同的原子或原子基团以共价键连接并因而失去对称性的四面体碳，也称手性碳原子。用C*表示手性分子非手性分子（二）旋光异构体的构型构型（D-,L-）：对于旋光异构体来说，是指不对称碳原子的四个取代基在空间的相对取向。1906年规定：D(+)-甘油醛，L(－)-甘油醛由于X射线衍射技术的发展，证实人为规定的甘油醛的构型与真实的构型一致。b)Fischer投影式：为了方便书写和比较，德国化学家Fischer提出的这种投影式，可看成是立体模型和透视式在纸面上的投影。书写Fischer投影式时规定：碳链处于垂直方向，羰基写在链的上端，羟甲基写在下端，氢原子和羟基位于链的两侧。立体模型和透视式：

立体异构体之间的差别，通常用立体模型、透视式或投影式来表示。

立体模型透视式透视式第三节

氨基酸的性质氨基酸的性质是鉴定、分离与分析的基础，也是蛋白质研究及分离分析的基础章首一、氨基酸的理化性质

α氨基酸为无色晶体，不同氨基酸其晶体形状不相同。

氨基酸熔点一般在200℃—300℃。

氨基酸的溶解度

各种氨基酸有不同的味感

氨基酸的比旋光度一般物理性质章首二、氨基酸的光吸收—紫外吸收在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝278nm，苯丙氨酸的max＝259nm，色氨酸的max＝279nm，一般采用280nm处的光吸收来测定蛋白质的含量。章首三氨基酸的离解性质氨基酸在水溶液中，并不是以游离的形式存在，而是离解成两性离子，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。PH1710净电荷+10-1

正离子

两性离子

负离子

等电点PI章首根据Handson－Hasselbanch公式AA可以看成多元酸，侧链不解离的中性AA可看作二元酸，酸、碱性AA可以看作三元酸。章首通过测定滴定曲线可求得AA的解离常数从A+出发，滴定到A0=A+时，用NaOH滴定，此时pH＝pKa，pH＝羧基的解离常数再加OH－，滴定到A0=A－时，pH＝pKa,pH=NH3的解离常数氨基酸的滴定曲线氨基酸的等电点

当溶液为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。中性氨基酸：pI=(pK’1+pK’2)/2

酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R-COO-

)/2

硷性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2章首氨基酸的等电点pI值相当于AA的两性离子状态两侧的基团pK值之和的一半。酸性碱性pI=(pK1+pK2)*1/2pI=(pK2+pK3)*1/2中性氨基酸：以Gly为例K1=[Gly±][H+][Gly+]K2=[Gly-][H+][Gly±]pI时，[Gly+]=[Gly-][Gly±][H+]K1=[Gly±]K2[H+][H+]2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI=（2.34+9.60）/2=5.97Gly酸性氨基酸，以Asp为例：碱性氨基酸，以Lys为例：氨基酸的酸碱性质在等电点以上的任何pH，氨基酸带净负电荷，在电场中将向正极移动；结论：在低于等电点的任何pH，氨基酸带净正电荷，在电场中将向负极移动。在一定pH范围内，氨基酸溶液的pH离等电点愈远，氨基酸所携带的净电荷愈大。章首除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。-氨基酸可变部分不变部分五、氨基酸的化学性质-氨基-羧基1．-氨基参与的反应酰化反应用途：用于保护氨基以及肽链的氨基端测定(丹磺酰氯)等。烃基化反应1．-氨基参与的反应用途：Sanger试剂(pH8~9)，用于N-末端测定等。PITCPTC-AAPTH-AA烃基化反应1．-氨基参与的反应用途：Edman试剂，用于N-末端及氨基酸序列测定等。四、氨基酸的化学性质1．-氨基参与的反应与甲醛反应用途：增强酸性，可用滴定法来直接测定氨基酸的浓度。四、氨基酸的化学性质

氨基酸与碱作用生成相应的盐。氨基酸的碱金属盐能溶于水,而重金属盐则不溶于水。2．

-羧基参与的反应成盐反应用途：谷氨酸钠-味精章首四、氨基酸的化学性质与茚三酮反应用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。A570nm3．-氨基和羧基共同参与的反应茚三酮水合茚三酮章首四、氨基酸的化学性质（2）成肽反应用途：是多肽和蛋白质生物合成的基本反应。3．-氨基和羧基共同参与的反应Arg的胍基α-萘酚次溴酸钠坂口试剂桃红色物用于鉴定ArgCys的-SH巯基乙醇HSCH2CH2OH过甲酸HCOOOH碘代乙酸ICH2COOH巯基-SH磺基HS3O-

肽链拆分，作用与Cyss上的二硫键His的咪唑基重氮苯磺酸Pauly试剂樱红色物（1His连2重）鉴定HisTyr的酚基重氮苯磺酸Pauly试剂桔黄色物

鉴定TyrTyr的酚基磷钼酸、磷钨酸Folin酚试剂兰色物质定量测定蛋白质、Tyr，见生化实验。Trp的吲哚基对二甲基氨基苯甲醛兰色物质鉴定Trp4．侧链基团的化学性质第二节、氨基酸的分离分析1）分配层析法的一般原理固定相（静相，B相）；可以是固相、液相或固-液混合相流动相（动相，A相）；可以是液相或气相分离的先决条件：各种成分的分配系数要有差异某物质在A相中的总量有效分配系数Keff=

某物质在B相中的总量章首滤纸层析,离子交换层析.纸层析

实验三纸层析Rf值

双向纸层析图2）离子交换层析－根据电荷不同的分离R+A－+B－→R+B－+A－阴离子交换阳离子交换树脂

羧甲基纤维素（CM-Cellulose）离子化基团–CH2COO－Na＋阴离子交换树脂

DEAE纤维素（DEAE-Cellulose）离子化基团－CH2CH2N(C2H5)3OH－蛋白质与离子交换树脂的结合是靠相反电荷的静电吸引的，吸引力的大小与蛋白质的带电量及溶液pH及离子强度。洗脱顺序是带相反电荷少，极性大的先出。离子交换层析：阳离子交换树脂-SO3H分离氨基酸常用的是带有耐酸性非常强的磺酸根SO3－Na＋（以盐的形式出现）的强阳离子交换树脂。首先将这种树脂填充到柱子中，在一定pH（大多数AA带正电）下，混合AA上柱，然后洗脱。按照它们与树脂结合的强弱程度不同逐一地洗脱下来洗脱顺序酸性→中→碱，在带电荷相同情况下，极性大的AA先洗下来。离子交换层析肽键:一个AA的α-氨基与另一个AA的α-羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键。第三节肽1．肽与肽键两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。肽：AA通过肽键连接形成的链状化合物。肽键的性质1、氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，有部分双键的性质。2、组成肽键的4个原子和2个相邻的Cα原子倾向于共平面，也称肽基平面或肽平面。肽键的这些性质在肽链折叠成三维结构中是很重要的。肽命名多肽化合物的名称，通常按照肽内氨基酸残基的排列顺序，以残基名称（如某某氨酰）从N端依次阅读到C端，并以C端残基全名结束肽的名称。N端、C端的概念：肽链的两个端点，N端的氨基酸残基的α-氨基未参与肽键的形成，即有自由的α-氨基。C端的氨基酸残基的α-羧基未参与肽键的形成，即有自由的α-羧基。命名举例氨基末端羧基末端下列五肽命名为丙氨酰谷氨酰亮氨酰缬氨酰组氨酸：节首2.肽的理化性质

1．两性解离与等电点肽与氨基酸一样具有酸、碱性质，它的解离主要取决于肽链的末端氨基、末端羧基和侧链R基。由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之间的距离比氨基酸中的大，因此它们之间的静电引力较弱。肽中C端-COOH的pK略大于氨基酸中的pK值，pK1↑。N端-NH+3的pK略小于氨基酸中的pK值，pK2↓。R基的pK变化不大。肽的等电点：肽所带净电荷为“零”时，溶液的pH值。

例：已知末端α-COOH，pK3.6，末端α-NH3+pK8.0ε-NH+3pK10.6。计算Ala-Lys-Ala的等电点。pI=(8.0＋10.6)/2=9.3天然存在的重要多肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。活活性肽：有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如如内啡肽，就是一种天然的止痛药。还有一些非常简单的肽也常用作食物的调味剂。如甜味剂Aspartame就是天冬氨酰苯丙氨酸的甲基酯。它的甜度是蔗糖的200倍，所以广泛用于食品饮料中。3．重要的肽谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成它的分子中有一个特殊的γ肽键，是由谷氨酸的γ羧基与半胱氨酸的α氨基缩合而成。由于GSH中含有一个活泼的巯基很容易氧化，二分子GSH脱氢以二硫键相连成氧化型的谷胱甘肽（GSSG）。节首谷胱甘肽重要的生物功能维护蛋白质活性中心的巯基参与二硫化合物相互转化某些酶的辅酶，在体内氧化还原过程中起重要的作用节首肽的应用及发展近年来，多肽的分离纯化、结构分析、化学合成、生物、放射免疫测定、免疫细胞化学以及遗传工程等新技术的应用，新的活性肽不断发现，对活性肽功能认识不断增长，促使这一领域迅速发展。return节首4、多肽人工合成在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.BruceMerrifield，他设计了一种肽的合成途径并定名为肽固相合成途径。是从C端向N端延伸。右图给出了肽固相合成途径的简单过程（合成一个二肽的过程）。第四节蛋白质的分离和鉴定1．分离纯化的基本步骤和原则1）取材选取含有目的蛋白质丰富的材料2）组织细胞破碎，条件尽可能温和，如匀浆法、研磨法、超声波、溶菌酶、渗透压休克法、压榨法。3）提取（初步提纯）必要时选用适当的溶液进行4）分离纯化溶液中进行，根据待分离Pr的特异理化性质，设计分离纯化方法5）结晶也是进一步纯化的步骤6）鉴定分析所得Pr的纯度，含量，相对分子量2．分离纯化的基本方法蛋白质的性质：溶解度、电荷性质、极性、分子大小、特异亲和力1）盐析与等电点沉淀

——根据溶解度不同的分离方法

A．盐析

B．等电点（蛋白不变性）3）凝胶过滤－根据分子质量不同的分离

凝胶过滤又称分子排阻或分子筛原理：比凝胶孔径大的分子不能进入球内网状结构

中的分子部分

小的分子完全所走路线不同得以分离，洗脱顺序大→中→小

4）亲和层析——根据特异亲和力不同的分离原理：不同蛋白质对特定配体（Ligand）的特异而非共价结合的能力不同。1）特异配体共价接到载体（如琼、脂糖），载体允许蛋白质通过2）混合蛋白质通过多糖载体－特异吸附3）改变条件洗下结合蛋白亲和层析5）电泳蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。6）聚丙烯酰胺凝胶电泳

PAGESDS,SDS(十二烷基磺酸钠)使蛋白质带负电，消除了电荷差异，不同蛋白质基本可根据不同分子量达到分离。常用于纯度鉴定和分子量测定实验8.5第五节蛋白质一级结构的测定蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。l某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过弱作用力结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。蛋白质复杂的组成和结构是蛋白质多种多样生物学功能的基础。蛋白质的分子结构

蛋白质的氨基酸顺序(一级结构)包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。

一.蛋白质的一级结构蛋白质一级结构测定的目的：*多肽链的氨基酸顺序*组成蛋白质的多肽链数目.*多肽链内或链间二硫键的数目和位置。蛋白质的一级结构是蛋白质生物功能的基础。2.蛋白质一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。

1，样品必需纯（>97%以上）；2，知道蛋白质的分子量。蛋白质一级结构测定的要求一级结构测定★片断重叠法的大体步骤：1）测定蛋白质分子中多肽链的数目，根据N-末端或C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量确定多肽链数目2）拆分蛋白质分子的多肽链，用变性剂(8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍)断开多肽链的二硫桥，对肽链进行拆分分离3）肽链完全水解－AA组成分析4）鉴定多肽链的N-末端，C-末端5）裂解多肽链成较小的片断，分离测定片断的氨基酸顺序6）比较两套以上片断的AA顺序，拼凑出整个肽链的AA顺序7）确定二硫键的位置一级结构测定1）二硝基氟苯法（DNFB、FDNB法）2）丹璜酰氯（DNS－CL）法丹璜酰氯－二甲氨萘璜酰氯缩写DNS－CL3）氨肽酶法氨肽酶是一种肽链外切酶，能从N-末端逐个向里切，测定不同时间释放AA的种类和数量推测N端序列，但酶对不同肽键敏感性不同，故难正确测定。N-末端分析一级结构测定二硝基氟苯法（FDNB法）1945年由Sanger发明此法曾用此方法测定了胰岛素的N-末端。氨基酸末端分析return二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）1956年hartley等提出灵敏度较高（比FDNB法提高100倍）样品量小于1毫微摩尔DNS-氨基酸稳定性较高此法优点氨基酸末端分析原理与DNFB相同，但丹璜酰基具有强烈的荧光，灵敏度比DNFB法高。C-末端分析肼解法还原法羧肽酶法氨基酸末端分析return多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。1）肼解法C-末端测定一级结构测定还原法氨基酸末端分析羧肽酶法主要方法根据氨基酸释放的动力学曲线，可确定该肽链的C端氨基酸顺序。氨基酸末端分析羧肽酶测定氨基酸C末端：常用的两种羧肽酶羧肽酶A：Arg、Lys、Pro除外羧肽酶B：仅Arg、Lys羧肽酶测定氨基酸的末端时，C端是Pro的情况下常用的两种羧肽酶A、羧肽酶B对此肽不作用

应用过甲酸氧化法或巯基还原法（保护）拆分多肽链间的二硫键，可以加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力。2）二硫键拆开及肽链的分离一级结构测定1、酸水解条件：6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸回流煮沸，反应约20小时。优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。2、碱水解条件：用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。缺点由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。优点是色氨酸在水解中不受破坏。３）氨基酸的组成分析水解后通过ＨＰＬＣ测定氨基酸的含量多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并用色谱、HPLC等方法将其分离开来。4）多肽链的部分裂解和肽段的分离基本要求：断裂点少、专一性强、反应产率高

一级结构测定化学裂解法：溴化氰水解法，选择性切割由Met的羧基所形成的肽键，断点少、产率高

。★多肽链的部分裂解一级结构测定★多肽链的部分裂解一级结构测定酶解法:胰蛋白酶：R1=LysorArg（水解快）

糜蛋白酶：R1＝PheTrp或Tyr（水解速度快）；胃蛋白酶：R1orR2＝Phe、Leu、Trp、Tyr及其他疏水性残基，水解快嗜热菌蛋白酶：R1＝Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr或Met（疏水性强的残基，水解快）

5）肽段的AA序列测定Edman降解法

酶水解法（外切酶）质谱法

测定每个肽段的氨基酸顺序一级结构测定肽段重叠法:利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。一级结构测定6.肽段在多肽链中次序的推断（7）二硫键位置的确定对角线电泳在肽链未拆分的情况下用胃蛋白酶水解之，可以得到被二硫键连着的多肽产物。先进行第一向电泳，将产物分开。再用过甲酸或者巯基乙醇加碘代乙酸处理，将二硫键打断。最后进行第二向电泳，条件与第一向电泳完全相同。选取偏离对角线的样品（多肽或寡肽），它们就是含二硫键的片段，上机测aa顺序，根据已测出的蛋白质的aa顺序，把这些片段进行定位，就能找到二硫键的位置。<3>羧肽酶A和B都对此肽不作用

<3>羧肽酶A和B都对此肽不作用

测定蛋白质的氨基酸组成时，常用的酸水解，氨基酸组成中的色氨酸被沸酸完全破坏；用DNFB测定N末端时，肽链中含有Lys除了生成DNP–氨基酸外还会生成ε-DNP-Lys羧肽酶测定氨基酸的末端时，C端是Pro的情况下常用的两种羧肽酶A、羧肽酶B对此肽不作用羧肽酶A：Arg、Lys、Pro除外羧肽酶B：仅Arg、Lys（7）蛋白质一级结构测序中遇到的特例：（7）．蛋白质测序举例(1)（7）蛋白质测序举例(2)<1>完全酸水解后产生的aa组成为：Ala、Arg、2Ser、Lys、Phe、Met、Pro<2>用DNFB处理并水解得到DNP-Ala和ε-DNP-Lys<3>羧肽酶A和B都对此肽不作用<4>用CNBr处理获得2个片段，其中一个片段含有Pro、Trp、Ser<5>用糜蛋白酶作用产生3个片段，1个含有Pro、Ser；另1个含有Met、Trp；最后一个含有Phe、Lys、Ser、Ala、Arg<6>用胰蛋白酶处理产生3个片段，1个含有Ala、Arg；另1个含有Lys、Ser；最后一个含有Phe、Trp、Met、Ser、Pro

蛋白质与生物进化

1．同功蛋白质—AA的种属差异和分子进化同功蛋白质：不同种属来源，行同种生物学功能的蛋白质。胰岛素：人、猪、羊、鲸等虽种属差异大，但其化学结构几乎相同，仅A链的第8、9、10位，或B30的4个AA有差异。人们常用同功蛋白质在组成上的差异来推断生物进化中亲缘关系的远近。实例：细胞色素Ｃ

进化树不同生物与人的Cytc的AA差异数目生物与人不同的AA数目黑猩猩0恒河猴