生物染色技术

2生物染色一、为什么要对生物样品进展染色？由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等清元素组成，这些元素对加某些部位质量的物质，均可作为染色剂。某些部位着上色，产生不同的折射率，因而提高反差，使这些部位能够看得清，易于与部位相区分。成，具有较强的电子散射力量，如铀、铅、锇、钨等重金属盐类。经重金属化合物浸染后，不同的构造成分将吸附不同数量的重金属原致密的黑色；结合重金属少的区域，电子散射力量较弱，电镜观看时颜色较浅；没有结合重金属的区域，是电子透亮区域。二、生物染色剂显微技术中所用的染色剂，又称生物染料，构造千变万化。生物染色剂的构造作为染色剂必需具备两个条件：一是具有颜色；二是要与被染组有两类根本基团：①发色基团；②助色基团。产生颜色的发色基团和与组织间产生亲和力的助色基团共同打算了染色剂的染色性质。①发色基团的作用是使染料产生颜色，由于它们能够吸取肯定波长的光线。如：硝基(-NO)(-N=N-、乙烯基=C=C、羰基=C=、2亚硝基〔－N=O〕等形成了发色基团；有的染料只有一个发色基团，但有的染料不只一个发色基团，它的颜色就比较深。②助色团的作用是使染料与组织产生亲和力，使染料能够结实地的局部相结合。如：酸性基团：羟基〔O、磺酸基〔SO、羧基〔COO〕3等碱性基团：氨基〔－NH2

、甲氨基〔－NHCH3

、二甲氨基〔－N(CH)〕等32没有助色基团的有色物质不能算做染料。33个硝基取代基团，它不溶解于水，也不能电离，不能与酸或碱形成盐类。假设三硝基苯分子中，用羟基再置换一个氢原子，就成为三硝基苯酚，即苦味酸，它即是一种黄色染料，有电离作用，与强碱能形成盐，这里的羟基便是助色基团。由此可知，苦味酸的颜色是由发色基团(硝基)所致，而它的染色性能则是由助色基团(羟基)形成的，如用氨基代替硝基，就形成无色化合物，不是染料。由此可见，作为染料，必需有发色基团和助色基团相互协作，缺一不行。三、生物染色剂的分类1．依据来源的不同，分为人工染料和自然染料生物染色剂都是有机化合物。如：龙胆紫、伊红、固绿等②自然染料：从动植物体中提炼出来的。如：洋红：从胭脂虫的雌虫身体提取出来的；番红：从番红花中提取出来的；苏木精：从豆科植物苏木中提取出来的〔用乙醚。酸性染料和碱性染料我们把助色基团中具有酸性或碱性基团的染料分别称为酸性或碱性染色剂。(体)简洁被碱性染料染成深色。试验中对染色质(体)进展染色，须使用龙胆紫溶液或醋3pH7(呈酸性)么把龙胆紫溶液称为碱性染色剂呢?pH值色剂。如伊红Y含有一个(-COOH)本身带负电荷。配制成伊红Y染料时，与强碱NaOH作用生成盐(-COONa)，此物质的Na+反而在溶液中呈碱性，所以不能认为酸性染料在溶液中就是酸性。等。上述伊红就是酸性染料，它是红墨水的主要成分，因此能与纸张中的纤维结实结合。再如固绿也是酸性染料，所以常用来染细胞质。碱性染色剂的助色基团电离后带有正电荷，所以能够与组织或细胞中带有负电荷的构造相结合，如细胞核中的染色质、木质部等。如苏木精、龙胆紫、番红、醋酸洋红等都是碱性染色剂。4地衣红地衣红待遇带有三个甲基，电离后本身带正电荷，所以能够与核酸中的磷酸基团相结合。溶液pH值对染料性质的影响pI4．07～4．5pH＜pI的冰醋酸溶液核酸。媒染剂和促染剂⑴媒染剂：一些既能与染色剂结合，又能与组织细胞结合的化学物质，如铁盐、铝盐、明矾等。媒染剂的作用主要有两个方面：①促进媒染剂与组织细胞相结合；②生成有色沉淀，增加染色效果，如使用醋酸洋红就需要加铁。⑵促染剂：本身不参与染色反响，但能够促进染料同组织细胞结合的化学物质，如硼砂、石炭酸等。比方核酸染料吡罗红配制中就可以加少量的石炭酸。四、中学常用的生物染色剂pH=pI4．07～4．5时不溶，只有低于或高于pI时才溶。所以常常用45%56FeClFe(OH)3 2的标本上，用解剖针在醋酸洋红中搅一搅就足够了。45%冰醋酸做溶剂，配成洋红的饱和溶液，20分钟，冷却后滤纸过滤，棕色瓶保存。醋酸洋红的使用技巧：染色过程中可以微微加热，目的是①促使15～20分钟。染后用自来水滴稍洗一下。龙胆紫：是混有甲基紫的结晶紫晶体。含有三个二甲氨基，故是碱性染料：着色力很强，常用于染细胞核、纺锤丝、纤毛、纤维蛋白、神经脱色的为革兰氏阳性细菌。2%0．25%的溶液，棕色瓶保存。市售的浓度多在1%，故要稀释，最好用2%冰醋酸稀释。10～2095%酒精褪色，要一滴一滴褪。每褪一次，马上用水冲掉，观看效果，如不够再重复上面步骤，切勿褪过头。吡罗红-甲基绿：是吡罗红与甲基绿的混合染料。吡罗红又称哌洛宁，和甲基绿都是核酸的染料。但二者与核酸的亲和力，受核酸RNA由于细胞中RNA酶的作用会很快发生解聚作用。甲基绿与聚合程度高的DNA结合力较强，而吡罗红则与聚合程度低RNA结合力较强。但这并不是确定的，与染料的浓度有关，一12：103：7。转变浓度吡罗红和甲基绿都会使DNA、RNA全部着色。吡罗红-甲基绿溶液的配制：3～5g100ml蒸馏水中，装入分液漏斗中，再参加一倍左右的氯仿，充分摇动，然后10～15分钟，使甲基紫溶解于氯仿中，放掉下层的氯仿。一般4～5次，直至下层的氯仿无色。⑵分别配制吡罗红溶液和甲基绿溶液：10．1M醋酸盐缓冲液：0．1M40ml+0．1M醋酸钠60ml0．1M醋酸：0．6ml醋酸+100ml蒸馏水0．1M醋酸钠：1．36g+100ml蒸馏水2%的甲基绿水溶液5%的吡罗红水溶液6ml+吡罗红水溶液+16ml+16ml。冰箱保存可用一段时间。20．25g+100ml+1g0．25g+100ml+1g③用前临时取：3+7份乙液留意：甲基绿也要事先去除甲基紫。吡罗红-10～15分钟。染色时间为20～30分钟，或者略多一点时间。结果是DNA呈绿色，RNA呈红色。詹纳斯绿：超活体染料，即只能进展体外活体染色的染料，由于化酶的活动，可以使詹纳斯绿变为氧化状态，故呈蓝绿色。而远离线粒体的部位则是复原状态，故