新型苏云金芽胞杆菌基因的分离、筛选及其杀虫特性研究,植物保护论文

新型苏云金芽胞杆菌基因的分离、筛选及其杀虫特性研究,植物保护论文几十年以前人们已经开场利用微生物来控制害虫。苏云金芽胞杆菌〔Bacillusthuringiensis，简称Bt〕是一种独特的细菌，它与很多化合物一起用于防治害虫，并且已做生意业化，对农业和环境有重要奉献。尽管其它细菌，包括乳状芽胞杆菌〔Bacilluspopilliae〕和球形芽胞杆菌〔Bacillussphaericus〕，也用作微生物杀虫剂，但是它们的杀虫活性谱与Bt相比特别有限。重要的是，Bt对人类是安全的，也是世界上应用最广泛的环境友好型生物杀虫剂。Bt杀虫基因已经转化到几种主要的作物中，获得了抗虫的转基因植物，进而提供了农业遗传工程模型。第9版的(伯杰氏细菌鉴定手册〕将其归属于第二类第十八群，革兰氏阳性，芽胞杆菌属的一个种。Cry1类杀虫晶体蛋白对多种鳞翅目害虫具有高效的杀虫活性，是Bt杀虫晶体蛋白中研究最为深切进入的一类，当前杀虫晶体蛋白的作用方式主要是通过Cry1类蛋白进行研究的。随着cry1类基因在杀虫工程菌和转基因抗虫植物中的广泛应用，抗Bt毒素的昆虫已经出现，由于这一威胁，人们希望得到能同时作用在同一害虫上的不同种类的Bt蛋白。由于Cry2Aa蛋白对鳞翅目和双翅目都有活性，所以对Cry1类蛋白产生抗性的昆虫，Cry2Aa蛋白对其也有活性。Cry2Aa与Cry1Aa的氨基酸序列同源性只要20%。然而这两种蛋白的三维空间构造非常类似。这讲明Cry2Aa蛋白的杀虫机制和很多其它Cry蛋白的杀虫机制类似。所以应用Cry2Aa来减缓抗性昆虫的出现是有价值的。人们已经提出交替使用Cry1A类和Cry2A类蛋白来解决抗性问题。长期以来，新型Bt基因的分离、挑选以及培育转Bt杀虫基因植物，一直是世界上诸多国家研究的热门。因而充分开掘我们国家Bt杀虫基因资源已经成为一项极有价值的工作。为此，本研究从土壤中分离Bt菌株并挑选和克隆杀虫基因，以期获得具有较高杀虫活性的新型cry1类和cry2类基因。1、材料与方式方法1.1材料1.1.1菌株与质粒本研究牵涉的菌株和质粒见表1。1.1.2培养基液体LB培养基：1.0%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1.0%氯化钠，pH7.0。固体LB培养基：在液体LB培养基中加1.3%琼脂。固体1/2LB培养基：1.0%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1.0%氯化钠、1.3%琼脂，pH7.0。1.1.3试剂限制性内切酶及连接酶、Pfu购自GiBcol、TaKaRa公司。dNTP、Taq酶等购自上海生工生物工程公司。分析纯化学试剂均为市售。1.1.4试虫小菜蛾〔Plutellaxylostella〕、棉铃虫〔Helicoverpaarmigera〕和亚洲玉米螟〔Ostriniafurna-calis〕来自中国农科院植物保卫研究所提供的标准化试虫。1.1.5PCR扩增引物鉴定引物与全长引物均由上海生工合成。引物序列见表2。1.2方式方法1.2.1晶体形态观察将Bt菌株V4在1/2LB培养基上培养48h后，将胞晶混合液滴于载玻片上，涂抹均匀，烘干固定，石炭酸复红染液染色3min，清水冲洗，100油镜进行镜检，石炭酸复红染液配制方式方法参见文献［11］。显微镜下观察晶体释放后，刮取培养物100mg用灭菌蒸馏水洗3-4遍，悬浮于1mL无菌水中，将芽胞和晶体混合液滴于玻璃片上，待其枯燥，经锇酸固定后酒精梯度脱水，临界点枯燥，离子溅射喷金〔2nm〕，HITACHIS-3400N扫描电镜观察拍照。1.2.2cry1Ea基因和cry2Aa基因的鉴定及测序参照宋福平等方式方法，通过cry1类全长通用引物L5un3/L3un3、cry2类半长通用引物S5un2/S3un2，以Bt菌株V4基因组为模板，利用Taq聚合酶进行PCR扩增，PCR反响体系为模板1L，引物对各1L，2Taqmix10L，ddH2O补至20L。PCR反响程序：94℃8min；94℃1min53℃1min，72℃4min，30个循环；最后72℃延伸10min。获得的cry1类PCR产物进行PCR-RFLP酶切分析，随后将PCR产物回收与pMD19-T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，挑选出阳性转化子，送于上海生工测序。根据已经发表的cry2Aa基因序列，参照文献设计了扩增全长cry2Aa开放阅读框的引物Q2AaF/Q2AaR，并进行cry2Aa全长基因的扩增，引物序列见表2。1.2.3cry1Ea和cry2Aa基因序列测定、诱导表示出及SDS分析以BtV4菌株的基因组为模板，利用KOD高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反响体系为：模板1L，引物对各1L，MgSO43L，dNTPs5L，10Buffer5L，KOD酶1L，ddH2O补至50L。PCR反响程序：94℃2min；98℃10s，51℃〔cry1Ea〕/54℃〔cry2Aa〕30s，68℃4min〔cry1Ea〕/2min〔cry2Aa〕，30个循环；最后68℃延伸10min。之后以下为参考文献［14］。1.2.4Cry1Ea蛋白纯化和Westernblot印迹Cry1Ea蛋白纯化用康为世纪的Ni-AgaroseHis标签包容体蛋白纯化试剂盒进行纯化。用Bio-RadMiniTrans-BlotElectrophoreticTransferCell装置进行Westernblot，封闭液为5%脱脂牛奶，一抗为MouseAnti-HisTagMonoclonalAntibody，二抗为Peroxidase-ConjugatedAffiniPureGoatAnti-MouselgG〔H+L〕。利用AEC酶底物试剂盒进行显色反响。1.2.5生物活性测定采用饲料混合法进行杀虫生物活性测定。将10mmol/LTris-Cl〔pH8.0〕溶解的粗提蛋白制备成蛋白样品溶液，将粗提蛋白溶液与饲料搅拌混匀，分装于经过消毒的培养皿中，挑选活泼踊跃的初孵幼虫接于饲料上，进行生物活性测定，每个处理重复3次，小菜蛾和玉米螟每个重复为30头试虫，棉铃虫每个重复为24头试虫。将10mmol/LTris-Cl〔pH8.0〕溶液作为阴性对照，利用同样的方式方法处理Cry1Ac蛋白作为阳性对照。试虫的饲养条件为28℃、相对湿度为70%-80%的光照培养箱中培养，小菜蛾初孵幼虫饲育48h、棉铃虫和玉米螟初孵幼虫饲育168h后调查死、活虫数量。2、结果2.1晶体形态观察Bt菌株V4产生的晶体形态，如此图1中光学显微镜下箭头所示，从左到右依次为双锥形晶体和立方形晶体；电镜图片中箭头所指，从左到右依次为立方形晶体和双锥形晶体。2.2cry1Ea基因和cry2Aa基因的鉴定PCR鉴定发现BtV菌株中含有cry1类cry2类基因，应用引物L5un3/L3un3和S5un2/S3un2对BtV4菌株的基因组进行PCR扩增结果，见图2和图3。对cry1类全长基因进行RFLP酶切分析，确定该基由于cry1Ea基因〔图4〕。参考测序结果，登录NCBI进行序列比对，发现该菌株含有cry2Aa基因。利用全长引物Q2AaF/Q2AaR扩增V4菌株中的cry2Aa基因，PCR扩增结果见图5。2.3cry1Ea和cry2Aa全长基因的克隆和表示出利用全长引物L5un3/L3un3和Q2AaF/Q2AaR扩增BtV4菌株中的cry1Ea和cry2Aa基因，将扩增产物分别克隆到pEB载体并挑选平末端连接正确的重组质粒pEB1Ea12和pEB2Aa16。对重组质粒pEB1Ea和pEB2Aa基因的测序结果显示，BtV4菌株中的cry1Ea全长基因大小为3507bp，编码1169个氨基酸残基，分子量为130kD，并在国际基因库GenBank中登记，其登录号为KF601559，由Bt-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ea12。该菌株中的cry2Aa全长基因大小为1917bp，编码639个氨基酸残基，分子量为60kD，并在国际基因库GenBank中登记，其登录号为KF667522，由Bt-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry2Aa16。华而不实，cry1Ea12与cry1Ea11类似性最高，类似度为98.12%，有65个碱基差异；cry2Aa16与cry2Aa15类似性最高，类似度为99.47%，有7个碱基差异。对cry1Ea和cry2Aa基因进行诱导表示出，对表示出产物进行的SDS电泳分析结果〔图6〕显示，两种表示出蛋白被检测均在沉淀组分中，转入重组质粒pEB1Ea12的Rosetta〔DE3〕菌株中检测到130kD的目的蛋白，在转入重组质粒pEB2Aa16的Rosetta〔DE3〕菌株中检测到60kD的目的蛋白，与Bt菌株V4产生的蛋白大小一致。以空质粒pEB转入Rosetta〔DE3〕菌株作为阴性对照，未发现表示出的130kD或60kD的蛋白，以上结果讲明在大肠杆菌中成功的表示出了上述蛋白。2.4Cry1Ea蛋白的纯化和Westernblot印迹为了进一步验证cry1Ea基因表示出能否正确以及蛋白纯度，对Cry1Ea蛋白进行纯化，并进行SDS蛋白电泳，结果见图7。Westernblot印迹结果，见图8。2.5Cry1Ea和Cry2Aa及BtV4蛋白杀虫活性的测定提取Cry1Ea和Cry2Aa表示出产物的沉淀组分以及Bt菌株V4蛋白进行杀虫活性测定，本试验进行了初筛杀虫活性测定。将3种蛋白分别设定一个浓度处理，对小菜蛾和棉铃虫为20g/g，对亚洲玉米螟为50g/g，每个处理重复3次，并用10mmol/LTris-Cl溶液作为阴性对照。初筛结果〔表3〕表示清楚，Cry1Ea和Cry2Aa蛋白对3种害虫的杀虫活性很低，但表现出明显的体重抑制，而同时含有该两种蛋白的Bt菌株V4蛋白的杀虫活性很高。由于供试昆虫数量缺乏，没有对Cry1Ea纯化蛋白进行生物活性测定，也没有做Cry1Ea和Cry2Aa两种蛋白的混合增效试验，有必要后续继续进行这两个试验。3、讨论本研究通过PCR扩增反响以及PCR-RFLP酶切鉴定，首先确定Bt菌株V4含有cry1Ea基因，随后发现该菌株也含有cry2Aa基因。Bt菌株V4同时含有cry1Ea和cry2Aa基因，对两种基因表示出的蛋白进行杀虫活性测定，结果并不理想。有3种可能解释杀虫活性的测定结果：一是由于碱基的差异导致Cry1Ea12和Cry2Aa16蛋白的空间构象发生改变，致使其杀虫活性明显降低，Cry1Ea和Cry2Aa蛋白对小菜蛾活性很高并且与其它蛋白具有显著的协同增效作用，而Cry2Aa与Cry1A类蛋白作用于昆虫的受体不同，这能够解释为什么Cry2A类蛋白能杀死对Cry1A类蛋白产生抗性的昆虫，所以Cry1Ea蛋白和Cry2Aa蛋白有可能具有协同增效作用，极大增加相互的杀虫活性，但由于供试昆虫数量缺乏，并没有做两种蛋白的协同增效试验；二是有可能存在其它未知基因，表示出的蛋白具有很高的杀虫活性；三是本试验采用包容体蛋白进行生物活性测定，但是包容体蛋白降解速率较快，而生物活性测定时间较长，这可能导致杀虫活性的降低。除此之外，Cry2Aa蛋白对双翅目也有高活性，能够对本试验的两种蛋白进行其它不同害虫的生物活性测定，因而有必要进行后续研究和重复性试验，这对于构建高效工程菌、转抗虫基因植物、解决昆虫对杀虫基因产生抗性等问题是有意义的。4、结论以本实验室分离得到的300株苏云金芽胞杆菌菌株DNA基因组为模板，利用cry1类全长通用引物进行PCR-RFLP基因鉴定，发现Bt菌株V4含有cry1Ea基因，克隆基因全长序列为3507bp，编码1169个氨基酸残基，分子量为130kD，