Tan第五章目的基因的导入和重组子的筛选

本课程内容第一章绪论第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的载体第四章目的基因的制备第五章目的基因导入和重组子的筛选第六章外源基因的表达第七章基因操作的基本技术第八章植物基因工程及应用第九章动物基因工程及应用第十章医学基因工程及应用1/31/20231欢迎同学们听课！第五章目的基因导入和重组子的筛选5.1DNA片段的连接重组5.2受体细胞选择的基本原则5.3基因转移5.4重组子的筛选1/31/20232欢迎同学们听课！5.1DNA片段的连接重组5.1.1DNA连接类型5.1.2DNA片段之间连接的方式5.1.3DNA重组中需注意的问题1/31/20233欢迎同学们听课！DNA分子连接

不同的DNA片段（目的基因和载体）经适当酶切后，在连接酶的作用下，连接在一起构建成重组DNA分子。1/31/20234欢迎同学们听课！5.1.1DNA重组（连接）的类型插入重组:载体上只有唯一的酶识别位点随机（非定向）插入置换重组(1)载体上有两个同样的酶识别位点随机（非定向）置换(2)载体上有两个不同的酶识别位点定向置换1/31/20235欢迎同学们听课！5.1.2DNA片段之间连接的方式具互补黏性末端片段之间的连接具平末端DNA片段之间的连接DNA片段末端修饰后进行的连接DNA片段加linkeroradaptor后的连接1/31/20236欢迎同学们听课！5.1.3DNA重组中需注意的问题两端具相同粘性末端的DNA分子会发生自身环化。对于置换重组，需将切割的DNA分子经过凝胶电泳分离，回收目的片段。无论单酶切还是双酶切，目的DNA分子均可能发生串联，必需检测重组DNA插入片段的分子大小。1/31/20237欢迎同学们听课！5.2受体细胞及其选择的基本原则5.2.1受体细胞5.2.2受体细胞选择的基本原则1/31/20238欢迎同学们听课！5.2.1受体细胞受体细胞（receptorcell）：又称为宿主细胞或寄主细胞（hostcell）从实验技术上讲：是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。从实验目的上讲：是有应用价值和理论研究价值的细胞。1/31/20239欢迎同学们听课！5.2.2受体细胞选择的原则外源DNA分子能稳定存在，限制酶缺陷型；重组基因缺陷型；易于转化/转导；易筛选遗传稳定性高，易于扩大培养；安全性高；内源蛋白酶基因缺失或缺陷；遗传密码无明显偏好性；具有较好的转译加工机制；较高的理论和实践应用价值。1/31/202310欢迎同学们听课！5.3基因转移（genetransfer）载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分子：

a.未连接的载体分子

b.未连接的DNA片段

c.载体的自连

d.含有错误插入片段的重组DNA分子

e.重组DNA分子

转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些DNA片段。自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入1/31/202311欢迎同学们听课！宿主细胞进行正常的复制。因此，需要将重组克隆鉴定出来。把重组DNA导入受体细胞进行扩增根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞及选择适宜的重组DNA导入的方式：转化、转染和转导。1/31/202312欢迎同学们听课！5.3基因转移（genetransfer）5.3.1重组质粒DNA分子转化大肠杆菌5.3.2重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌5.3.3重组DNA分子转入真核细胞1/31/202313欢迎同学们听课！5.3.1重组质粒DNA分子转化大肠杆菌5.3.1.1细菌转化的机制5.3.1.2化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法）5.3.1.3电激法（电穿孔转化法）5.3.1.4转化率的计算及其影响因素1/31/202314欢迎同学们听课！5.3.1.1细菌转化的机制转化(transformation)：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。

自然界中，转化并不是细菌或的遗传信息的主要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的转化，进一步的研究发现，这类细菌含有DNA结合和吸收的代谢机制。正常条件下，大部分细菌包括大肠杆菌，只能吸收有限的DNA，为了提高转化效率，建立了一系列的转化方法：a.热激法转化感受态细胞b.PEG介导的原生质体转化

1/31/202315欢迎同学们听课！c.高压电穿孔法转化d.显微注射法转化e.接合转化f.噬菌体转染1/31/202316欢迎同学们听课！表4—1大肠杆菌常用转化方法的比较转化方法转化效率Ca诱导107-8原生质体转化105-6噬菌体转化107-8电穿孔法106-9（<100Kb）结合转化104-51/31/202317欢迎同学们听课！5.3.1.2化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法）

原理：0ºC、低浓度（50～100mM）CaCl2，Ca2+改变细胞膜的磷脂层结构，提高膜的通透性，而且增强进入细胞的DNA分子抗DNase的能力。

特点：操作简便，不需特殊仪器，一般实验室均可进行。转化率在5106～2107个转化子/g质粒DNA范围内，完全可满足常规克隆的需要。1/31/202318欢迎同学们听课！5.3.1.2化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法）感受态细胞制备：

感受态细胞：指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。菌种活化、培养、收菌和进行CaCl2处理。DNA分子转化感受态细胞：冰浴、42ºC热激、37ºC恢复、涂板培养。1/31/202319欢迎同学们听课！5.3.1.3电激法（电穿孔转化法）原理：利用高压电脉冲作用，在细菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA的有效吸收。

特点：1.感受态细胞制备简单；2.转化率高达109～1010个转化子/g质粒DNA；3.用途广泛，但需特殊仪器电激仪。除感受态细胞制备及转化与化学法不同之外，其余步骤包括所设转化对照与化学法相均相同。1/31/202320欢迎同学们听课！5.3.1.4转化率的计算及其影响因素转化率：是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率。转化率计算：＝转化子总数/DNA分子总数或质量或＝转化子总数/受体细胞数实际中按转化子总数/DNA分子质量(g)计算1/31/202321欢迎同学们听课！影响转化效率的因素受体细胞的感受态，它决定转化因子能否被吸收进入受体细胞；受体细胞的限制酶系统和其他核酸酶，它们决定转化因子在整合前是否被分解；受体和供体染色体的同源性，它决定转化因子的整合；重组DNA分子大小重组DNA纯度、浓度1/31/202322欢迎同学们听课！5.3.2重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌转染(transfection)：采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，将重组噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程，称为转染。效率较低，103～104个噬菌斑/gDNA，较难满足一般实验要求，实践中少用。转导(transduction)：是指通过噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。效率高，可达103～104个噬菌斑/gDNA，需进行体外包装。1/31/202323欢迎同学们听课！体外装配（invitropackaging）：λDNA的转染效率不高，如果将重组的λ分子装配成头-尾结构的病毒粒子，将极大的提高效率。1/31/202324欢迎同学们听课！噬菌体转化大肠杆菌的方法1/31/202325欢迎同学们听课！噬菌体转化大肠杆菌的方法1/31/202326欢迎同学们听课！λ噬菌体的体外装配有两种不同的系统可以应用：

一种是cos位点突变的噬菌体的单品系系统。

另一种系统需要两种不同的缺陷品系一个是基因D的突变体，另一个品系是基因E的突变体，由于蛋白质合成的缺陷。体外的装配过程可以利用两种不同培养物的混合物，含有完整的外壳蛋白，完成装配过程。将装配的噬菌体接入细菌就可以完成正常的侵染过程。1/31/202327欢迎同学们听课！λ噬菌体体外装配的两种系统1/31/202328欢迎同学们听课！噬菌斑λ和M13噬菌体都能形成噬菌斑，λ形成的是真正的噬菌斑(透明)，是由于细胞的裂解引起的；而M13的噬菌斑是浑浊的，因为细胞并未裂解，它引起的是细菌生长的减慢，而使细菌的浓度低于周围细胞。1/31/202329欢迎同学们听课！重组噬菌体的鉴定（一）利用插入失活鉴定

M13噬菌体，多种λ噬菌体载体都含有lacZ’基因，可以通过插入失活鉴定重组噬菌体。

（二）λ噬菌体的cI基因的插入失活

λ噬菌体载体在cI基因位点上含有单一的酶切位点，该位点上插入外源基因可以导致该基因的失活，引起表现型的变化。正常的噬菌斑是浑浊的，但重组的噬菌斑是清亮的。

（三）利用Spi(sensitivetoP2inhibition)表型选择

一般来讲，λ噬菌体不能侵染已被P2噬菌体侵染的大肠杆菌细胞，因此λ噬菌体被称为Spi+（对P2前噬菌体抑制敏感），插入新的DNA后，能变成spi-，可以侵染含有P2噬菌体的细菌，只有重组子是Spi-可以形成噬菌斑，因此可以很方便的选择出来。1/31/202330欢迎同学们听课！（四）根据λ基因组的大小筛选

λ装配系统，只有37kb-52kb的DNA分子可以进入头部结构，小于37kb的不能装配。许多构建的λ载体切除了部分DNA，因而小于37kb，只有插入外源DNA分子后才能被装配到头部结构中，使载体的长度等于或大于37kb。对于这样的λ噬菌体载体，只有重组的噬菌体才能进行正常的复制。1/31/202331欢迎同学们听课！利用lacZ'基因的插入失活筛选重组噬菌斑1/31/202332欢迎同学们听课！5.3.3重组DNA分子转入真核细胞重组DNA分子导入植物细胞－植物基因工程(见后面第八章)重组DNA分子导入哺乳动物细胞－动物基因工程(见后面第九章)1/31/202333欢迎同学们听课！5.4重组子筛选的方法5.4.1遗传表型直接检测法5.4.2依赖重组子结构特征分析的筛选法5.4.3基因表达产物分析法5.4.4DNA序列测定法1/31/202334欢迎同学们听课！5.4.1遗传表型直接检测法根据载体的选择标记的初步筛选根据插入序列的表型特征筛选重组子1/31/202335欢迎同学们听课！通过插入失活可以初步筛选重组子，但筛选到的克隆是否插入了正确的片段，还需要进一步的鉴定，鉴定的方法主要有如下几种情况：

1限制性内切酶法：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以通过这些限制性酶酶切重组质粒，电泳分析插入片段长度是否正确。

2PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通过PCR的方法进行鉴定

3菌落原位杂交法：将在后面的章节中提到。

4基因产物检测法：如果使用的是表达载体，那么就可以通过鉴定基因产物的方法鉴定正确的克隆。1/31/202336欢迎同学们听课！抗药性选择标记插入失活/插入表达筛选法pBR322有许多单一切点的限制性位点，可以用来切开分子插入新的DNA片段。如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，但仍能表达氨苄抗性基因，对四环素是敏感的。筛选重组pBR322按照以下方法进行，将转化细胞培养于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。这属于负向选择

1/31/202337欢迎同学们听课！根据载体的选择标记的初步筛选抗药性选择标记插入失活/插入表达筛选法-半乳糖苷酶显色反应筛选法（－互补筛选）利用报告基因筛选植物转化细胞利用遗传选择标记筛选哺乳底物转基因细胞1/31/202338欢迎同学们听课！1/31/202339欢迎同学们听课！利用tetR的插入失活筛选重组克隆1/31/202340欢迎同学们听课！抗药性选择标记插入表达筛选法正向选择重组子在培养基上能生长，而非重组子不能生长。1/31/202341欢迎同学们听课！-半乳糖苷酶显色反应筛选法（－互补筛选）载体：含有β-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列和头146个aa的编码序列

宿主：缺失了lacZ基因，可编码β-半乳糖苷酶C端序列

α-互补：lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。

在这样的系统中，转化质粒的细菌获得了amp抗性，自连质粒可以合成正常的酶，而重组质粒的细菌不能合成正常的酶。在培养基中添加酶的诱导物IPTG，乳糖的类似物X-gal乳糖酶作用下显示蓝色，蓝斑是载体自连产物，而白色克隆是重组质粒。这一系统称为lacselection。1/31/202342欢迎同学们听课！X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。

1/31/202343欢迎同学们听课！利用lacZ'基因的插入失活筛选重组子1/31/202344欢迎同学们听课！植物转基因载体的选择标记/报告基因新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferaser-II,NPTII)基因:抗新霉素（neomycin）或卡那霉素（kanamycin）潮霉素磷酸转移酶(hygromycinphosphotransferase,HPT)基因:抗卡那霉素或潮霉素（hygromycin）氯霉素乙酰转移酶(chloraphenicolacetyltransferase,CAT)基因:抗氯霉素-葡萄糖酸苷酶(-Glucuronidase,GUS)基因:

荧光检测或组织化学检测，非正向选择抗除草剂bar基因：抗PPT（L-谷氨酸的类似物）1/31/202345欢迎同学们听课！动物转基因载体的选择标记基因氯霉素乙酰转移酶(chloraphenicolacetyltransferase,CAT)基因:抗氯霉素新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferaser-II,NPTII)基因:抗新霉素（neomycin）或卡那霉素（kanamycin）胸苷激酶基因（thymidinekinase,TK）二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)基因黃嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)1/31/202346欢迎同学们听课！5.4.2依赖重组子结构特征分析的筛选法5.4.2.1菌落裂解琼脂糖凝胶电泳快速检测法5.4.2.2限制性内切酶酶切分析检测5.4.2.3PCR法检测5.4.2.4核酸分子杂交检测法1/31/202347欢迎同学们听课！5.4.2.1琼脂糖凝胶电泳检测原理：根据外源DNA片段插入的重组质粒与载体DNA之间大小的差异来区分重组子和非重组子。特点：操作简单、快捷，成本低，适合大规模筛选。特别适用于插入片段较大的重组子的筛选。1/31/202348欢迎同学们听课！5.4.2.2限制性内切酶酶切分析检测原理：小量抽提质粒DNA，利用限制性内切酶酶切，通过电泳分析确定是否含有插入片段及其大小、插入方向。特点：可以区别假阳性重组子，结果判断较准确，但操作比较复杂，不适用于大规模的筛选。1/31/202349欢迎同学们听课！5.4.2.3PCR法检测原理：利用载体上已知序列设计的引物