第三章 细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学

研究方法进行初步观察形成可验证的假说设计对照试验收集资料解释结果作出合理结论查阅已有知识生物学研究模式生物1/31/20232Caenorhabditis

elegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana1/31/20233第一节细胞形态结构的观察方法1/31/20234一、光学显微镜技术（lightmicroscopy)（一）普通复式光学显微镜技术光学显微镜的组成分三部分1/31/20235双筒显微镜的优点为同时用两眼观察，有较强的立体感。普通双筒显微镜

1/31/20236**分辨率是指区分开两个质点间的最小距离。

D=0.61λ/N∙Sinα/2

其中D——分辨率；

λ——光源波长；

N——介质折射率；α——物镜镜口角（标本在光轴的一点对物镜镜口的张角）**对任何显微镜来说，重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。

1/31/20237人眼的分辨率0.2mm，光学显微镜的分辨率0.2μm，而电子显微镜可达0.2nm。应用：细胞形态的观察和组织学研究。在光学显微镜下能观察到的细胞内部结构，称为显微结构。如线粒体、叶绿体、中心体、核仁等。1/31/20238光镜样品的制作：固定→包埋→切片→染色甲醛石蜡5μm1/31/20239（二）荧光显微镜技术(fluorescencemicroscope)1/31/202310特点：

1.利用汞灯或氙灯作为荧光激发光源，波长较短，分辨率高于普通显微镜；

2.有两个特殊的滤光片。应用：对细胞内生物大分子进行定性、定位研究。反射波长低于510nm的光520~560nm的绿色荧光透过450~490nm蓝光透过透过波长超过510nm的光物镜样品目镜激发滤光片阻断滤光片1/31/202311荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）1/31/202312（三）激光扫描共焦显微镜技术原理：

用激光作为荧光的激发光。物镜与聚光镜聚焦到同一个点，只有来自焦平面的光聚焦成像，排除漫反射和散射光。使图像清晰，提高灵敏度和分辨率。

应用：用来观察样品中荧光的分布状况，与荧光显微镜相比，图像更清晰，结合计算机软件处理，获得三维立体图像。(

laserscanningconfocal

microscope,LSCM

)1/31/202313蓝色为细胞核，绿色为微管1/31/202314（四）相差显微镜(phasecontrastmicroscope)原理：

利用光衍射和干涉特性，通过添加物镜后焦面上相差板和聚光镜下的环状光阑，使相位差变为振幅差，人为地增加明暗对比。应用：用于观察未染色的活细胞。相差显微镜的光学部件及光线通路1/31/202315相差显微镜观察的活细胞1/31/202316二、电子显微镜技术(electronmicroscope)（一）电子显微镜的基本知识电镜与光镜光路图比较1/31/202317显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理光学显微镜电子显微镜200nm近0.1nm可见光（波长约400~700nm）电子束（0.01~0.9nm）玻璃透镜电磁透镜不要求真空要求真空1.33x10-5~1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差*

*1.电子显微镜与光学显微镜的基本区别1/31/2023182.电子显微镜的基本构造1）电子束照明系统：电子枪、聚光镜。

2）成像系统：物镜、中间镜、投影镜。

3）真空系统4）记录系统电子枪阳极聚光镜样品室物镜中间镜投影镜观察窗荧光屏1/31/202319（二）主要电镜制样技术简介

用于观察的电镜生物样品要求：①

超薄；②更好的保持精细结构；③有一定的反差

1.超薄切片技术

（1）固定（2）包埋（3）切片（4）染色电子显微镜样品的制备过程1/31/202320莱卡超薄切片机

1/31/2023212.负染色技术用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，凹陷处铺了一薄层重金属盐，而样品凸出的地方则没有染料沉积，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像“透明”地光亮。**负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。用于观察病毒、细菌、噬菌体、生物大分子或亚细胞碎片的结构亚单位或其三维结构。1/31/202322肌动蛋白纤维的负染电镜照片1/31/2023233.冷冻蚀刻电镜技术用于显示膜结构、内表面等。1/31/202324冰冻蚀刻电镜照片细胞断裂面结构

1/31/202325（三）扫描电子显微镜

(scanningelectronmicroscope，SEM)原理：

电子枪发出的电子束被汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行扫描，电子束可激发样品表面放出二次电子。二次电子由探测器收集，转变成光电信号，控制荧光屏上的电子束强度。应用：

观察样品表面的形貌特征。JEOL扫描电子显微镜

1/31/202326蛙内耳毛细胞扫描电镜投影图特点及应用：成像具强烈的立体感，适于观察精细的立体表面结构。分辨率3nm，不能观察活的生物样品、细胞的全貌以及内部结构。1/31/202327三、扫描隧道显微镜

(scanningtunelingmicroscopy,STM)原理：

利用量子力学的隧道效应，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品表面时，针尖和样品间产生隧道效应，并且隧道电流（I）和针尖与样品之间的间距（d）呈指数关系，这样由I可知d，即针尖的位置可以确定，由此样品的表面形貌也可确定。1/31/202328特点：

1.具原子尺度的高分辨率（纵分辨率可达0.001nm）；2.可在真空、大气、接近于生理环境的液体等条件下工作；3.非破坏性测量，无电子束轰击，避免形变。应用：观察DNA、RNA、蛋白质及生物膜、病毒等结构。1/31/202329第二节细胞组分的分析方法1/31/202330一、细胞的分离与纯化动植物组织单细胞悬液混合细胞群体单一类型的细胞或细胞器酶解沉降、离心或抗原抗体结合特性流式细胞分选仪1/31/202331二、用超速离心技术分离细胞器与生物

大分子及其复合物

组织匀浆分离出各组分差速离心密度梯度离心差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。1/31/202332三、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法为了测定细胞组分，利用一些显色剂与被检测物质中一些特殊基团特异性结合，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。1/31/202333DNA：Feulgen反应，酸解去除RNA及DNA上的嘌呤，暴露出DNA上的醛基，与Schiff试剂反应呈紫红色。RNA：Brachet反应，可被派洛宁染成红色。多糖：PAS反应，过碘酸将多糖氧化成高分子醛化合物，与Schiff试剂反应呈紫红色。1/31/2023341/31/202335脂肪：四氧化锇反应，呈黑色；苏丹Ⅲ（深红色）、苏丹黑。蛋白质：米伦（Millon）反应，呈粉红色或砖红色；重氮反应。酶：与底物共同温育，形成电子密度的沉淀物。1/31/202336四、特异蛋白抗原的定位与定性（一）免疫荧光技术抗原：能刺激机体产生抗体的物质。抗体：由抗原刺激在机体内产生，并与抗原发生特异性结合的蛋白质的总称。多克隆抗体：由不同的B淋巴细胞产生的抗体混合物。1/31/202337免疫荧光技术：将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来，研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。利用荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。1/31/202338免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架1/31/202339（二）免疫电镜技术将抗体进行特殊标记后用电子显微镜观察免疫反应的结果。免疫胶体金技术：将抗体与金颗粒偶联，经免疫染色后，在电镜下金颗粒所在部位即为抗原位置。1/31/202340甲肝病毒TZ84株免疫电镜照片1/31/202341蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白区带转移硝酸纤维素滤膜与抗蛋白抗原的第一抗体反应与辣根过氧化酶相连的抗第一抗体的第二抗体孵育与底物二氨基苯胺(DAB)反应相应条带处着色证明有该蛋白抗原的存在（三）免疫印迹技术

可从混合蛋白质中检测特定的蛋白质是否存在。

该技术灵敏，可检测微量的特定蛋白质。方法：1/31/202342未标记的一抗与目的蛋白结合；洗膜去除未结合的一抗后，加标记的二抗孵育；二抗与一抗结合，洗膜去除未结合的二抗；最后加底物，二抗偶联的标记物催化底物反应产生可检测信号。1/31/202343五、细胞内特异核酸序列的定位与定性（一）原位杂交技术用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法，称为原位杂交。人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片1/31/202344（二）Southern印迹技术是体外分析特异DNA序列的方法。提取总DNA酶切琼脂糖凝胶电泳NaOH处理使双链DNA变性为单链DNA转移至硝酸纤维素膜与放射性标记的探针杂交放射自显影显示目的基因在凝胶片上的位置1/31/202345

1.Southern印迹杂交法限制性内切酶酶切

检测杂交信号

提取DNA

Southern法可用于检测特异的DNA序列片段,进行基因定位、分子量测定等。1/31/202346

2.Northern印迹杂交法

（基本过程类似于Southern法）

提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或显色→检测信号。

Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA

1/31/202347六、利用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态

放射性自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶感光，从而对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的技术。1/31/202348步骤：1.用放射性同位素（如14C和3H）标记的前体分子导入生物体；2.取样制片，在切片表面涂乳胶（AgBr或Agcl

）；3.经放射性曝光，放射出的电子将Ag＋还原成金属银颗粒，在该处形成潜在的影像；4.经显影后，使潜在的影像还原成黑色的金属银颗粒；5.定影处理后可显示黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量。1/31/202349七、定量细胞化学分析技术（一）显微分光光度测定技术

利用细胞内某些物质对特异光谱吸收的原理，用来测定这些物质（核酸、蛋白质）在细胞中的含量。

分紫外显微分光光度测量法和可见光分光光度测量法。1/31/202350（二）流式细胞仪以激光作为发光源。将待测细胞用荧光染色，制成单细胞悬液。激光束使带有不同荧光细胞的液滴充电，通过高压偏转板时，充电的液滴偏离原来的流动方向，而不带电的液滴不偏向。达到分选细胞的目的。流式细胞仪分选细胞的示意图激光分析仪检测器1/31/202351第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术1/31/202352

体外培养的动物细胞可分为原代细胞：是指从机体取出后立即培养的细胞，一般指培养的第2代至传10代以内的细胞。传代细胞：是指适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞。**一、动物细胞培养

原代细胞培养步骤：胰酶或胶原酶与EDTA，将细胞从体内分离出来，在模拟体内环境的条件下，让其生存和生长。1/31/202353有限细胞系（cellline）：细胞传至50代以后，又出现危机，不能再传下去，这种传代次数有限的体外培养细胞称为有限细胞系。细胞系（cellline）：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，但极少数细胞能够渡过危机传至50代左右，这些传代细胞称为细胞系。

**仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制行为染色体改变，呈亚二倍体或非整倍性，失去接触抑制永生细胞系：在传代过程中部分细胞发生遗传突变，带有癌细胞的特点，在培养条件下可无限传代，这种传代细胞又叫连续细胞系。**1/31/202354肿瘤细胞失去接触抑制行为1/31/202355细胞克隆：利用单细胞克隆培养或通过药物筛选的方法从某一细胞系中选择单个细胞，并由此增殖形成具有基本相同遗传性状的细胞群体称为细胞克隆。****细胞株（cellstrain）：经生物学鉴定，具有特殊的遗传标记或性质的细胞克隆，称为细胞株。

1/31/202356利用植物细胞具有的全能性。

单倍体细胞培养原生质体培养（二）植物细胞培养1/31/202357植物原生质体培养一般采用植物的体细胞。先经纤维素酶处理去掉细胞壁，这种脱去细胞壁的细胞称为原生质体。将原生质体放在合适的培养基上，经过诱导分化可以重新长成植株。1/31/2023581/31/202359二、细胞工程（一）细胞融合与细胞杂交技术细胞融合通过培养和诱导，两个或多个细胞融合为一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合或细胞杂交。动物细胞融合一般用灭活的病毒（如仙台病毒）或化学物质（如PEG）介导；植物细胞融合时，先用纤维素酶去掉纤维素壁。（二）单克隆抗体技术1975年英国科学家Milstein和Kohler所发明，并获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。原理：B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。

1/31/202361（三）细胞拆合与显微镜操作技术1.细胞拆合：把细胞核与细胞质分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。物理法细胞拆合分为化学法1/31/202362显微操作仪2.显微操作技术：在显微镜下，用显微操作仪对细胞进行解剖和微量注射的技术。正在进行核移植操作1/31/202363第四节用于细胞生物学研究的模式生物1/31/202364模式生物的共同特征：a.个体小；b.易培养；c.操作简单；d.生长繁殖快。1/31/2023651.病毒结构简单，基