发酵工程第八章

发酵过程控制第八章定义发酵过程即细胞的生物反应过程，是指由生长繁殖的细胞所引起的生物反应过程。不仅包括了以往“发酵”的全部领域，而且还包括固定化细胞的反应过程、生物法废水处理过程和细菌采矿等过程。研究发酵过程的意义发酵体系的特征内容发酵过程控制概述温度对发酵的影响及其控制pH值对发酵的影响和控制溶解氧对发酵的影响和控制CO2和呼吸商对发酵的影响和控制基质浓度对发酵的影响及其控制通气搅拌对发酵的影响及其控制泡沫对发酵的影响及其控制高密度发酵与过程控制发酵终点的检测与控制自动控制技术的应用发酵过程控制概述常规发酵工艺控制参数直接状态参数：温度、pH值、搅拌转速、液位、补料速率等间接状态参数：产物浓度、溶解氧、溶解CO2等发酵过程优化控制步骤控制方式：

一般检控系统包括3个部分发酵控制FermentationControl

SampleAnalysispHDOSugarAmmoniaPhosphateSulphateProductsPrecursorsContaminationPressureprobeLevelprobepHprobeTbeDOprobeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationSugar/Oilfeed发酵过程参数检测发酵过程参数的检测是控制发酵过程的重要依据检测方法通过仪器在线检测发酵罐中取样离线检测常用的检测仪器在线检测：传感器离线检测：分光光度计、气相和液相色谱仪等直接状态参数：直接反应发酵过程中微生物生理代谢状况的参数对传感器的要求：耐高温、高压；避免表面被微生物堵塞有价值的状态参数：尾气分析和空气流量的检测间接状态参数：采用直接状态参数计算得到的参数

离线发酵分析法没有一种可在线监测培养基成分和代谢产物的传感器发酵液的基质、前体、代谢产物和菌量的监测通过人工取样和离线分析缺点：不连贯性和滞后性发酵过程的代谢控制调节营养物质通过细胞膜进入细胞的能力调节代谢流调节酶的合成量调节酶的催化活力发酵过程检测控制的主要的参数----物理参数检测参数检测方法

单位

影响温度铂电阻

热敏电阻

℃

μqPc*罐压(0.20.5×105Pa)隔膜传感器压敏电阻Pa保持正压，防止染菌O2及CO2

的溶解度搅拌转数频率计数器

r/minKla

发酵液的均匀性

搅拌功率(2-4KW/m3)功率计kWKla空气流量浮子流量计

孔板差压计

m3h-1vvmKla粘度旋转粘度计

PasKla浊度浊度计%反映单细胞的生长

料液的流量蠕动泵

荷重传感器量筒Lh-1

S发酵过程检测控制的主要的参数-----化学参数检测参数检测方法

单位

影响及作用pH复合玻璃电极

菌体和产物合成速度酶促反应的方向基质浓度产物浓度HPLC离子选择电极生物传感器取样gL-1

μqP发酵周期的长短氧化还原电位氧化还原电位电极mV生长和生化活性溶氧浓度覆膜氧电极

%qo2气相O2含量

顺磁氧分析仪

Pa反映OUR和Kla气相CO2含量

红外气体分析仪

%反映OUR和Kla发酵过程检测控制的主要的参数-----生物参数检测参数检测方法单位影响菌丝形态摄像显微镜取样镜检

反映菌体发育阶段和正常与否菌体浓度取样：干重、浊度、活菌计数、离心沉降gL-1

影响菌体的生化反应Kla一、温度对发酵的影响及控制1影响发酵温度的因素：发酵热产热因素生物热通气热搅拌热散热因素蒸发热辐射热1.1发酵热发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。

Q发酵=Q生物+Q搅拌+Q通气-Q蒸发-Q辐射发酵热的测定方法一：

通过测定一定时间内冷却水的流量和冷却水的进出口温度，由下式求得这段时间内的发酵热：

Q发酵=GC(t2-t1)/V(J/m3·h)

G---冷却水流量，kg/h

C---水的比热，J/kg·℃

t1、t2---进、出口的冷却水温度，℃

V----发酵液体积，m3方法二：

通过罐温的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自动控制装置测得温度随时间上升的速率S,按下式可求得发酵热：

Q发酵

=K·SS---温度随时间上升的速率，℃/hK---总参数，代表系统的热容量，J/L·℃K值可由下式求得：

K=(MCp)发酵液

+(MCp)容器

+(MCp)附件M

—

以每升发酵液计的发酵液、容器、附件的重量Cp—

代表各自的比热一般微生物发酵过程中的最大发酵热约为

4.186×(3000～8000)kJ/m3·h生物热是生产菌在生长繁殖时产生的大量热量。培养基中碳水化合物、脂肪、蛋白质等物质被分解为CO2、NH3和水时释放出的大量能量。用途：合成高能化合物供微生物生命代谢活动合成产物热能散发1.2生物热影响生物热的因素

生物热随菌株、培养基、发酵时期的不同而不同对于某一种微生物，生物热的产生具有强烈的时间性

孢子发芽和生长初期，产生数量有限

进入对数生长期后，大量产生，此后逐渐减少生物热的大小还与菌体的呼吸强度有对应关系培养基成分越丰富，菌体利用营养物质速率越大，生物热产生越多在四环素发酵中，可看到当产生的生物热达到高峰时，糖的利用速度也最大。有人提出，可从菌体的耗氧率来衡量生物热的大小。

四环素生物合成过程中系列参数的动态变化过程1：效价；2：呼吸强度；3：生物热；4：糖浓度通风发酵都有大功率搅拌，搅拌的机械运动造成液体之间、液体与设备之间的摩擦而产生的热。

Q搅拌=3600（P/V）3600：热功当量（kJ/（kW.h））

（P/V）：通气条件下单位体积发酵液所消耗的功率（kW/m3）1.3搅拌热通入发酵罐的空气，其温度和湿度随季节及控制条件的不同而有所变化。空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换。必然会引起水分的蒸发；蒸发所需的热量即为蒸发热。1.4蒸发热1.5辐射热：由于发酵罐内外温度差，通过罐体向外辐射的热量。辐射热可通过罐内外的温差求得，冬天影响大，夏天影响小一般不超过发酵热的5%。2温度控制

在发酵罐上安装夹套或盘管调节温度高时，通过循环冷却水控制温度低时，通过加热使夹套或盘管中水的循环实现对温度的控制3温度对发酵的影响影响各种酶的反应速率和蛋白质性质影响发酵液的物理性质：影响氧的溶解和传递；影响对基质的分解和吸收速度影响生物合成的方向温度对微生物生长的影响

温度直接影响酶反应，从而影响着生物体的生命活动。微生物的生长和产物的合成在酶的作用下进行

微生物的生长是一系列复杂的生化反应的综合结果，反应速率受到温度的影响发酵过程，微生物生长速率变化

dX/dt=μX-αXμ:比生长速率

α：比死亡速率当处于生长状态时，μ>>α,α可忽略。

μ与α与温度有关根据Arrenhnius公式

μ=Ae-E/RT

α=A’e-E’/RT

通常E’大于E，所以α比μ对温度变化更为敏感

例：青霉菌生产青霉素青霉菌生长活化能E=34kJ/mol

青霉素合成活化能E=112kJ/mol

青霉素合成速率对温度较敏感，温度控制相当重要。微生物的适宜温度多数微生物：20ºC-40ºC嗜冷菌：20ºC以下生长速率最大；嗜中温菌：30-35ºC嗜热菌：50ºC以上生长筛选高温菌株具有重要的实践意义温度对微生物生长的影响

嗜冷菌在温度低于20℃下生长速率最大嗜中温菌在30-35℃左右生长速率最大嗜热菌在50℃以上生长速率最大

曲线形状相似；当温度增加10℃，生长速率大致增长一倍。

温度超过最适生长温度，生长速率随温度增加而迅速下降3.1温度对微生物生长的影响在最适温度范围内不同生长阶段的微生物对温度的反应不同延迟期：敏感最适温度对数生长期：最适温度范围内提高温度生长后期：取决于溶解氧浓度，提高通气量温度和微生物生长的关系

一方面在其最适温度范围内，生长速度随温度升高的增加；另一方面，不同生长阶段的微生物对温度的反应不同3.2温度对基质消耗的影响温度的变化影响基质消耗和比生长速率生产中，适当抑制生长(菌体的过量生长导致群体的退化和产率降低）温度对产物合成影响不大时，适当提高温度抑制生长，有利于生产节能3.3温度对产物合成的影响影响各种反应速率改变发酵液的物理性质，影响产物的合成影响生物合成的方向对代谢有调节作用

例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于30℃温度下，该菌种合成金霉素能力较强。当温度提高，合成四环素的比例也提高。在温度达35℃则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。

低温时，氨基酸合成途径的终产物对第一个酶的反馈抑制比正常温度时大，因此在抗生素发酵后期，降低温度，使蛋白质和核酸的正常合成途径关闭，转向目的产物的合成最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长或发酵产物的生成。最适发酵温度与菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段有关。最适发酵温度的选择在发酵整个周期内仅选一个最适培养温度不一定好。温度的选择要参考其它发酵条件。温度的选择还应考虑培养基成分和浓度最适温度的确定最适温度的选择1）根据菌种及生长阶段选择微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为370C，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30～320C，青霉菌生长温度为300C。前期菌量少，取稍高的温度，使菌生长迅速；中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。后期产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，提高温度，刺激产物合成到放罐。如：四环素生长阶段28°C，合成期26°C后期再升温；黑曲霉生长37°C，产糖化酶32～34°C。但也有的菌种产物形成比生长温度高——谷氨酸产生菌生长30～32°C，产酸34～37°C。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。二阶段发酵菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同。通过实验来确定不同菌种各发酵阶段的最适温度，采取分段控制。变温培养抗生素生产中，通过变温培养比恒温培养得到的产物多。最适温度的选择和控制，可有效的提高产物的产率例如：

青霉素产生菌的最适生长温度是30℃，而最适于青霉素合成的温度是20℃。

发酵过程中，在生长初期抗生素还未开始合成，菌丝还未长浓，这时的温度应适于微生物的生长；到抗生素分泌期，菌丝已长到一定浓度，积累抗生素是重点考虑，此时应满足生物合成的最适温度。例：林可霉素发酵的变温培养问题的提出接种后10h左右已进入对数生长期，随后是10h左右的加速生长期，在40h左右对数生长期基本完成，在50h左右转入生产期主要问题：如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期？适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数量的有强生产能力的菌丝体存在变温培养的正交设计结论：前60h按31℃控制，缩短了适应期使发酵提前转入生产阶段，同时菌丝体已有相当量的积累，为大量分泌抗生素提供了物质基础60小时后将罐温降至3O℃使与抗生素合成有关的酶的活性增强，抗生素分泌量有所增加，同时因分泌期的延长有利于进一步积累抗生素发酵进入后期罐温再回升至31℃使生产菌在生命的最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物。2）根据培养条件选择温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可高些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。3）根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，前期温度可高些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。利用温度控制提高产量的实例：热冲击处理技术提高发酵甘油的产量实验：正交条件

A冲击温度（0C）40，45，50

B开始时机（h）8，16，30

C冲击时间（分）15，30，60结果发酵16小时，45°C冲击30分钟最佳，发酵96小时后甘油浓度提高32.6％。（A）16h,45°C,30min（B）12h,45°C,30min

利用计算机模拟确定最佳发酵条件，正逐步得到推广应用。

●

根据模拟计算机对发酵温度最佳点的计算，得到青霉素发酵的最适温度是：起初5h维持在30℃；随后降到25℃，培养35h；再降到20℃培养85h；最后回升到25℃培养40h放罐。●采用这种变温培养，比在25℃恒温培养青霉素产量提高15%。发酵温度的控制在发酵罐上安装夹套和蛇罐，通过循环冷却水控制。冷却介质：深井水或冷冻水控制方式：手动控制或自动控制温度计温度控制器调节阀

二、

pH对发酵的影响及控制发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一重要发酵参数。对菌体的生长和产品的积累有很大影响。因此，必须掌握发酵过程中pH的变化规律，及时监测并加以控制，使其处于最佳状态。尽管多数微生物能在3~4个pH单位的pH范围内生长，但是在发酵工艺中，为了达到高生长速率和最佳产物形成，必须使pH在很窄的范围内保持恒定。不同种类微生物，对pH要求不同；酵母：pH3.8－6.0细菌：pH6.5－7.5霉菌：pH4.0－5.8放线菌：pH6.5－8.0pH不同，微生物代谢产物不同。黑曲霉pH：2－3，柠檬酸发酵pH：7.0，草酸发酵谷氨酸菌pH：7－8，GA发酵pH：5.0－5.8，谷氨酰胺发酵酿酒酵母pH：4.5-5.0－3，乙醇发酵pH：8.0，甘油发酵pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响

生长合成pH对菌体生长影响比产物合成影响小例青霉素：菌体生长最适pH3.5~6.0,产物合成最适pH7.2~7.4

四环素：菌体生长最适pH6.0~6.8，产物合成最适pH5.8~6.0XpH微生物生长和发酵的最适宜pH可能不同。丙酮丁醇菌生长：pH5.5－7.0;发酵：pH4.3-5.3;链霉素菌生长：pH6.3-6.9发酵：pH6.7-7.3青霉素菌生长：pH6.5-7.2发酵：pH6.2-6.8pH值变化的原因微生物代谢活动分泌酸或碱性物质利用培养基中的生理酸性盐或碱性盐注意初始pH的选择和发酵过程中pH的变化的控制，适宜于菌体生长和产物合成几种抗生素合成的最适PH值链霉素、红霉素：中偏碱性6.8-7.4金霉素、四环素：5.9-6.33青霉素：6.5-6.8pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响pH影响酶的活性pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态pH影响培养基某些组分和中间代谢产物离解pH不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变影响菌体原生质膜电荷的改变，引起膜对离子的渗透作用，影响营养物的吸收和代谢产物的分泌。例如：黑曲霉在pH2-3时，发酵产生柠檬酸，在pH接近中性时，则产生草酸。如：丙酮丁醇发酵中，发酵后期pH为4.3-5.3时积累丙酮丁醇，pH升高则丙酮丁醇产量减少，而丁酸、乙酸含量增加。举例：影响菌体的生长：产黄曲霉的细胞壁的厚度就随pH值的增加而减小：其菌丝直径在pH6.0时为2～3μm；pH7.4时为2～18μm，并呈膨胀酵母状；pH值下降后菌丝形态又会恢复正常。影响产物合成：合成青霉素的最适pH值范围为6.5～6.8。影响产物稳定性：β-内酰胺抗生素沙纳霉素的发酵中，pH在6.7～7.5之间时抗生素的产量相近，高于或低于这个范围，合成受到抑制。在这个pH值范围内，沙纳霉素的稳定性未受到严重影响；但pH>7.5时，稳定性下降，半衰期缩短，发酵单位也下降。青霉素在碱性条件下发酵单位低，也与青霉素的稳定性有关。发酵过程中pH的变化及影响pH变化的因素发酵过程中pH的变化1）生长阶段

pH有上升或下降趋势（相对于接种后起始pH而言）如：利福霉素B发酵起始pH为中性，但生长初期由于菌体产生的蛋白酶水解蛋白胨而生成铵离子，使pH上升至碱性；随着铵离子的利用及葡萄糖利用过程中产生的有机酸使pH下降到酸性范围。2）生产阶段

在生产阶段，pH趋于稳定，维持在最适产物合成的范围3）自溶阶段

菌丝自溶阶段，随着基质的耗尽，菌体蛋白酶活跃，培养液中氨基氮增加，致使pH上升，此时菌丝趋于自溶而代谢活动终止。培养基中营养物质的代谢引起pH的变化培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。若阴离子氮源被利用后产生NH3，pH上升；有机酸的积累，使pH下降。一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH转移，与碳氮比直接有关。生理酸性物质和生理碱性物质的消耗2、引起发酵液中pH变化的因素

发酵过程中pH的变化取决于微生物的种类、培养基的组成和发酵条件。

在菌体代谢过程中，菌体本身有建成其生长最适pH的能力，但外界条件发生较大变化时，pH将会不断波动。以产生利福霉素SV的地中海诺卡菌进行发酵研究，采用pH值为6.0、6.8、7.5三个出发值，结果发现：pH值在6.8、7.5时，最终发酵pH值都达到7.5左右，菌丝生长和发酵单位都达到正常水平；pH值为6.0时，发酵中期pH值只达4.5，菌浓仅为20％，发酵单位为零。这说明菌体仅有一定的自调能力。碳源过量消泡油添加过量生理酸性物质的存在引起pH下降的因素氮源过多生理碱性物质的存在中间补料，碱性物质添加过多引起pH上升的因素原则：有利于菌体生长和产物的合成。一般根据实验结果确定。最适pH与菌株、培养基组成、发酵工艺有关。应按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH范围。最适pH的选择

微生物生长阶段和产物合成阶段的最适pH往往不同，这不仅与菌种特性有关，也取决于产物的化学性质。例如：

一般产生碱性抗生素的，如灰色链霉菌生产链霉素、红色链霉菌产生红霉素，其合成产物的最适pH为6.8-7.3，中性偏碱；而产生两性抗生素的，如金色链霉菌生产金霉素，其合成产物的最适pH为5.9-6.3,弱酸性。最适pH与微生物生长，产物形成之间相互关系有四种类型：菌体比生长速率μ和产物比生产速率QP的最适pH在一个相似的较宽的范围内（比较容易控制）；μ较宽，Qp范围较窄，或μ较窄，Qp范围较宽（难控制，应严格控制）；μ和Qp对pH都很敏感，其最适pH相同（应严格控制）；更复杂，μ和Qp对pH都很敏感，并有各自的最适pH（难度最大）；调节基础培养基的配方调节碳氮比（C/N）添加缓冲剂补料控制直接加酸加碱补加碳源或氮源pH的控制应用青霉素发酵

通过调节加糖速率来控制pH值的方法，与恒速加糖和酸碱控制法相比，产量提高了1/4链霉素发酵

补充氨控制pH值，控制的同时补充了产物合成所需的氨。pH的控制系统pH电极设定控制器调节阀6.5pHUncontrolledControlled经消毒的pH电极装入发酵罐内，定时直接测定培养基的pH，同时还可以与控制仪表连接，通过回路系统控制阀门或泵进行pH调节。pH控制的常用方法

配制合适的培养基加入非营养基质的酸碱调节剂加入基质性的酸碱调节剂加入生理酸性盐或碱性盐基质把pH的控制和代谢调节结合，通过补料控制pH值的具体调节方法：1)

添加CaCO3。有机酸发酵时形成钙盐沉淀。但是，碳酸钙用量大，消毒困难，易堵塞管道，在操作上易引起染菌，而且对产物的提取有影响。此法在工业上不使用。2)

氨水流加法3)

尿素流加法尿素流加法：味精厂多用。

尿素首先被菌体尿酶分解成氨，氨进入发酵液，使pH上升，当NH4+被菌体作为氮源消耗并形成有机酸时，发酵液pH下降；

随着尿素的补加，氨进入发酵液，又使发酵液pH上升及补充氮源，如此循环，致至发酵液中碳源耗尽，完成发酵。

氨基酸发酵常用此法。这种方法既可以达到稳定pH值的目的，又可以不断补充营养物质，特别是能产生阻遏作用的物质。

少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。即采用补料的方法，可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH值和培养液的特性(如菌浓等)等几个目的。在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH，如（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH(2)当NH2-N低，pH低时补氨水；当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH

应急措施：改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度，控制有机酸的积累量及其代谢速度；改变温度，以控制微生物代谢速度；改变罐压及通气量，降低CO2的溶解量；改变加油或加糖量等，调节有机酸的积累量；

分别在4种缓冲介质中，于pH6．50一9．50测定天冬酰胺酶酶活力．1甘氨酸介质pH8.00时酶活力最高；2硼酸在pH8．50，酶反应最快3磷酸在pH8．50，酶反应最快4Tris在pH8．50，酶反应最快酶活1＞2＞4＞3不同调pH方法的影响天冬酰胺酶大多数发酵过程是好氧的，因此需要供氧。如果考虑呼吸的化学计量，则葡萄糖的氧化可由下式表示：C6H12O6

十6O2＝6H2O十6CO2

只有当这两种反应物均溶于水后，才对菌体有用。氧在水中的溶解度比葡萄糖要小约6000倍左右(氧在水中的饱和度约为l0mg/L)

。许多发酵的生产能力受到氧利用限制，因此氧成为影响发酵效率的重要因素。三、氧对发酵的影响溶解氧的高低供氧效率微生物细胞耗氧状况

在线监测发酵液中溶解氧的浓度，了解氧的供需规律及其对微生物生长和产物合成的影响。在发酵罐内安装溶氧电极测定

电极的要求耐高温、高压、长时间灭菌以及具有长期的稳定性，精度和准确度±3%左右菌体的代谢是受发酵液中溶氧浓度的影响，依据总需求来供氧是欠妥的。溶氧浓度对比摄氧率(QO2每克干菌体每小时所消耗的氧的毫摩尔数)用米氏型曲线表示。

DissolvedOxygenConcentrationQO2Ccritical发酵过程的溶氧变化发酵前期菌丝体大量繁殖，需氧量大于供氧，溶氧出现一个低峰。在生长阶段，产物合成期，需氧量减少，溶氧稳定，但受补料、加油等条件大影响。补糖后，摄氧率就会增加，引起溶氧浓度的下降，经过一段时间以后又逐步回升并接近原来的溶解氧浓度。如继续补糖，又会继续下降，甚至引起生产受到限制。发酵后期，由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度上升，一旦菌体自溶，溶氧浓度会明显上升发酵中溶氧异常下降的原因：1

污染好气性杂菌，大量溶氧被消耗掉2

菌体异常代谢3

设备或者工艺控制发生故障，搅拌速度明显下降、加消泡剂过多，引起溶氧下降。

发酵中溶氧异常上升的原因菌体异常代谢，污染烈性噬菌体，菌体破裂后完全失去呼吸能力，溶氧就直接上升。

临界氧浓度（C临）：指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度，或微生物对发酵液中溶解氧浓度的最低要求。可通过尾气中氧气含量的变化和通气量共