体内药物分析

1体内药物分析2生物样品分析方法的基本要求常用样品的种类、采集和贮藏生物样品分析前处理技术定量分析方法的验证3常用样品的种类、采集和贮藏1、血液（blood）——血浆、血清和全血(1)血样的采集：注射器直接采集静脉血（人、兔子）毛细管眼眶采血、静脉插管手术或断头取血（大鼠、小鼠）滞留针股静脉取血（狗）(2)血样的制备：测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。①血浆(plasma)的制备抗凝剂：肝素（最常用）、EDTA、椐橼酸盐、草酸钙、氟化钠。4②血清(serum)的制备血浆比血清的分离快，而且制取的量约为全血的50%~60%，血清只为全血的20%~40%，多数研究者用血浆进行分析测定。③全血（wholeblood）的制备血样主要用于药物动力学、生物利用度等研究及临床治疗药物浓度监测。52、唾液（saliva）一些药物的唾液药浓(S）与血浆游离药浓（P）密切相关。因此，TDM中利用对S的测定代替对P的监测——药代动力学的研究(1)唾样的采集：在潄口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰)。(2)唾样的制备：唾样采集后，立即测量其除去泡沫部分的体积，以3000rpm离心10min，取上清液直接测定或冷冻保存。63、尿液（urine）体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型、Ⅰ相及Ⅱ相代谢物等多种形式排出。测定方式——测定一定时间内排入尿中的药物总量样本采集——时间尿（在规定时间区间内采集），并测量每次收集的尿液体积。7

生物样品的贮藏最常用的方法——冷藏或冷冻冷藏或冷冻的时限：经稳定性考察后确定冷藏：冰箱(4℃)中——短期保存(1~2d)冷冻：冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃)中——长期保存 1、血样的贮藏采集后及时分离血浆和血清（≤2h），分离后置硬质玻璃试管中或EP管中完全密塞后再贮存。2、唾液样品的贮藏测定唾液pH时应在取样的当时测定。为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4℃以下保存3、尿样的贮藏采集后应立即测定（≤24h），若不能立即测定，加入防腐剂后保存，保存时间为24~36h(4℃)或长期(-20℃)。8生物样品分析前处理技术1、去除蛋白质(1)目的：结合型药物释放；减少乳化的产生；保护仪器去除蛋白质的方法；(2)方法：①加入与水混溶的有机溶剂——蛋白质脱水沉淀常用的有机溶剂——乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等②加入中性盐——“盐析”沉淀蛋白质常用中性盐——饱和(NH4)2SO4、Na2SO4、Mg2+、PO43-及枸橼酸盐等9③加入强酸——与蛋白质阳离子(铵基)形成不溶性盐沉淀常用的强酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等

④加入重金属盐——与蛋白质阴离子(羧基)形成盐沉淀当溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐沉淀。 常用的沉淀剂——CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等10⑤酶水解法——蛋白分解酶分解蛋白质加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用。⑥超滤法半透膜滤除可溶性生物大分子物质(蛋白质)；以多孔性半透膜(超滤膜)作为分离介质的一种膜分离技术；⑦加热法—蛋白质变性凝固测定对热稳定性好的组分时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白沉淀。112、缀合物的水解(1)酸水解——优点：简便、快速缺点：专一性较差、药物分解(2)酶水解——优点：专一性较强、药物无分解；缺点：时间长、费用大(3)溶剂解缀合物（主要是硫酸酯）往往在萃取过程中可被加入的溶剂分解，称作溶剂解 目前对缀合物的分析，逐渐趋向直接测定缀合物的含量，体内以缀合物形式存在的药物的量，排出体外时，缀合物占所有排出药物总量的比率123、分离、纯化与浓集(1)目的：①消除内源性物质、代谢物及其他共存物质的干扰；②提取浓缩待测物质，使其易于检测(2)方法：①液—液萃取法(传统的方法)ⅰ：液-液萃取时应考虑选用的有机溶剂的特性、体积及水相的pH值等因素ⅱ：萃取方法萃取次数——通常为1次(萃取R在70%以上)，必要时2~3次(萃取R在50%以下)每次用量——和水相的体积比通常为1:1或2~5:1萃取方式——分液漏斗或涡流混合13ⅲ：水相pH值水相pH值——由药物的pKa确定——90%以上的非电离形式碱性药物最佳pH值：高于pKa值1~2个pH单位酸性药物最佳pH值：低于pKa值1~2个pH单位一般规则：碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值介质中提取；生物样品宜在碱性或近中性条件下提取——生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取。ⅳ：其他方法A：离子对提取法（ion-pairextraction）——种有机溶剂提取离子性药物的方法B：提取烷基化法——适用于离子化倾向较大，难以用溶剂直接提取的极性药物。14②液-固提取法（liquid-solidextraction，LSE）液－固提取法是近十几年来在纯化生物样品时被广泛采用的方法。也可以认为是规模缩小的柱色谱法。这种方法是应用液相色谱法原理处理样品。将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱，以溶剂淋洗后，将生物样品通过，使其药物或杂质保留在担体上，用适当溶剂洗去杂质，再用适当溶剂将药物洗脱下来。与LLE相比较，LSE具有如下优点：LSE较少引入杂质；消除了LLE的主要缺陷――乳化现象；提取效率高；可用少量生物样品进行分析（如50~100ul的血浆样品）；柱为可弃型，废弃物易从实验室移走；再最后洗脱中多采用以水为主的溶剂系统，大大增加了安全型；最大的优点为处理样品速度快、并在室温下操作，尤其适用于处理挥发性及对热不稳定药物。15（3）被测组分的浓集样品在提取过程中，虽然被测组分得到了纯化，但因微量的组分分布在较大体积（数毫升）的提取溶剂中，提取液往往还不能直接进行分析。一些分析方法如GC法和HPLC法等都受到进样量的限制，若将提取液直接注入仪器，被测组分量可能达不到检测灵敏度，因此，常需要使组分浓集后再进行测定。浓集的方法主要有两种：一种方法是在末次提取时加入的提取液尽量少，使被测组分提取到小体积溶剂中，然后直接吸出适量供测定。另一种方法是挥去溶剂时应避免直接加热，防止被测组分破坏或挥失。挥去提取溶剂的常用方法是直接通入氮气流吹干；对于易随气流挥发或遇热不稳定的药物，可采用减压法挥去溶剂。16

4、化学衍生化分离前将药物进行化学衍生化的目的是：（1）使药物变成具有能被分离的性质；（2）提高检测灵敏度；（3）增强药物的稳定性；（4）提高对光学异构体分离的能力等。药物分子中含有活泼Ｈ者均可被化学衍生化，如含有－COOH、－OH、NH2、、－NH－、－SH等官能团的药物都可被衍生化。化学衍生化对GC和HPLC尤为重要。17（一）特异性 内源性物质不得干扰原药、代谢物（二）标准曲线

r≥0.9900，至少5个浓度，不许外延（三）精密度和准确度

RSD≤15％、20％ 相对回收率85～115