第二章中药化学成分提取分离方法

第二章中药化学成分提取分离方法

一.中药化学成分的提取(一)溶剂提取法依据：化学成分的溶解性（极性）关键：提取溶剂的选择溶剂的选择原则：相似相溶的原则，价廉、易得、无毒、安全等。提取方法：浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法。常用提取溶剂性能特点提取溶剂性能特点适宜提取成分提取方法强极性溶剂溶解范围广生物碱盐穿透能力强苷类水易得、安全糅质煎煮法糖类渗漉法有些脂溶性成分溶解不完全氨基酸有些苷类成分的酶解蛋白质水提液易发霉、变质水溶性杂质多，过滤困难沸点高，浓缩困难亲水性有机溶剂（和水可任意混溶）除去多糖、溶解范围广（不同浓度乙醇）蛋白质外渗滤法（稀醇）水溶性杂质溶出少的大多数浸渍法乙醇可抑制酶的活性化学成分回流法提取液不易发霉、变质均可连续回流法大部分可回收利用但有挥发性、易燃烧甲醇溶解特点与乙醇相似，但有毒丙酮溶解性能同乙醇，但沸点低、易挥发，作为提取溶剂不常用；但对色素溶解性能好，在分离、精制时常用。亲脂性有机溶剂对化合物溶解选择性较强，水溶性杂质少、易纯化，游离生物碱回流法挥发性大、易燃烧、有毒，苷元连续回流法价格昂贵，对提取设备要求高，某些苷类穿透力较弱，提取时间长，作为提取溶剂不常用。乙醚bp.35℃，极易燃氯仿bp.61℃、d1.480，不易燃，毒性大对生物碱溶解性好苯bp.80.1℃，毒性大石油醚沸程30~60℃、60~90℃、90~120℃脱脂、脱色常用于甲醇、乙醇不能任意混溶（二）水蒸气蒸馏法适用于挥发性成分（主要是挥发油）的提取

（三）二氧化碳超临界流体萃取技术（CO2-SFE）超临界流体萃取技术：以超临界流体作为萃取介质的一种提取新技术。超临界流体：处于临界温度（Tc）、临界压力（Pc）以上，介于气体与液体之间的流体。特点：具有液体和气体的双重特性，如：密度与液体近似黏度与气体近似对很多物质有很强的溶解能力扩散系数是液体的100倍（不及气体）中药提取常用的超临界流体：二氧化碳（CO2）优点：1.临界温度（Tc=31.4）接近室温,热敏成分稳定.2.临界压力（Pc=7.37MPa）不太高,易操作.3.本身呈惰性，与化合物不反应.4.价格便宜.超临界流体萃取中药成分的主要优点：1.可以在接近室温下工作，防止热敏成分的破坏或逸散。2.萃取过程几乎不用有机溶剂，萃取物中无溶剂残留，对环境无污染。3.提取效率高，节约能耗。二．中药化学成分分离与精制方法分离依据分离方法分离原理或特点二相萃取法分配系数（K）差异逆流分溶法（CCD）液滴逆流色谱法（DCCC）高速逆流色谱法（HSCCC）液-液分配柱色谱正相色谱和反相色谱加压液相色谱法正相色谱和反相色谱快速色谱低压液相色谱（LPLC）中压液相色谱（MPLC）高压(效)液相色谱法（HPLC）分配系数（K）差异溶解度差异溶剂沉淀法水提醇沉法（水/醇法）除去多糖、蛋白质等水溶性杂质醇提水沉法（醇/水法）除去树脂、叶绿素等脂溶性杂质醇/醚（丙酮）法皂苷的纯化（除去脂溶性杂质）酸/碱法生物碱的分离纯化碱/酸法酸性成分（如苷元）的分离纯化试剂沉淀法钙、钡、铅盐沉淀法酸性成分的分离生物碱沉淀试剂沉淀法生物碱的分离纯化结晶及重结晶化合物的进一步精制溶解度差异物理吸附（表面吸附）无选择性、吸附可逆、可快速进行，应用较多硅胶极性吸附剂氧化铝极性吸附剂吸附性差别活性炭非极性吸附剂化学吸附有选择性、吸附牢固或不可逆、洗脱难，应用较少碱性氧化铝对酚酸类（黄酮、蒽醌）的吸附酸性硅胶对生物碱的吸附半化学吸附吸附力介于上述二者之间、力量较弱聚酰胺（氢键吸附）大孔吸附树脂吸附原理（范德华引力或产生氢键）分子筛原理（本身多孔性结构的性质决定的）吸附性差别透析法(半透膜膜孔的分子筛作用)凝胶滤过法(三维网状结构的分子筛作用)超滤法(分子大小不同引起的扩散速度的差别)超速离心法(溶质在超速离心作用下沉降性的差别)蛋白质的脱盐精制蛋白、多糖的分离及小分子化合物的分离大分子化合物精制分离同上分子大小差别

离子交换树脂法氨基酸、生物碱、有机酸的分离阳离子交换树脂阴离子交换树脂离解程度不同常用色谱分离方法介绍：吸附色谱吸附剂分离原理吸附规律应用硅胶吸附原理弱酸性、极性吸附剂广泛（酸、碱及化合物极性越大、中性成分均可）吸附能力强（难洗脱）溶剂极性越小，吸附力越强

氧化铝吸附原理碱性、极性吸附剂碱性、中性成分吸附规律同上（酸性成分与铝络合）活性炭吸附原理非极性吸附剂从稀水溶液中富集微量物质吸附规律与上相反脱色（脂溶性色素）聚酰胺氢键吸附酚羟基数目多，吸附力强能形成分子内氢键者，吸附力下降黄酮、蒽醌的分离母核芳香化程度高者，吸附力增强除鞣质水（介质）中吸附力强，水洗脱力弱大孔吸附树脂吸附原理非极性化合物易被非极性树脂吸附

糖与苷的分离分子筛原理溶剂中溶解度增大，吸附力下降（从水提液富集苷类）

非极性树脂，极性小的溶剂洗脱力强生物碱的精制液-液分配色谱（分配原理）类型固定相流动相应用正相色谱水>BAW系统极性、中极性物质分离（以PPC为例）反相色谱ODS<甲醇-水、乙腈-水最广泛，非极性、中极性各类物质的分离

加压液相色谱类型压力（Pa）分离规模分析用高压液相色谱（HPLC）>20.2×1051mg左右制备用高压液相色谱（HPLC）>5mg中压液相色谱(MPLC)5.05~20.2×105>100mg低压液相色谱(LPLC)<5.05×10510mg~1g快速色谱约2.02×105>10mg葡聚糖凝胶色谱类型原理溶胀溶剂应用

葡聚糖凝胶分子筛（大→小）水多糖、多肽、（SephadexG）蛋白质分离羟丙基葡聚糖凝胶分子筛（糖苷）水、极性有机溶剂适于不同类型（SephadexLH-20）吸附原理（苷元）或二者的混合溶剂化合物分离离子交换吸附树脂树脂类型原理应用阳离子交换树脂离子交换从酸水溶液中吸附碱性成分（生物碱）强酸性（R-SO3-H+）（阳离子）（除去酸性、中性成分）弱酸性（-COO-H+）阴离子交换树脂离子交换从碱水溶液中吸附酸性成分（有机酸）强碱性（RN+(CH3)3CI-）（阴离子）（除去碱性、中性成分）弱碱性(伯、仲、叔胺)三、结构研究化合物纯度的判定方法1．结晶均匀、一致。2．熔点明确、敏锐（0.5~1.0℃）3．TLC(PPC):三种以上不同展开剂展开，均呈现单一斑点。4．HPLC、GC也可以用于化合物纯度的判断。（二）四大光谱在结构测定中的应用紫外—可见光谱（UV-VIS）——共轭体系特征分子中电子跃迁（从基态至激发态）。其中，n-π*、π-π*跃迁可因吸收紫外光及可见光所引起，吸收光谱将出现在光的紫外区和可见区（200~700nm）。200nm400700nm紫外区（UV）可见区（VIS）应用：推断化合物的骨架类型——共轭系统，。取代基团的推断。如加入诊断试剂推断黄酮的取代模式（类型、数目、、排列方式）用于含量测定（以最大吸收波长作为检测波长进行含量测定）。

红外光谱（IR）分子中价键的伸缩及弯曲振动所引起的吸收而测得的吸收图谱，称为红外光谱。40003600300015001000625cm-1特征频率区指纹区特征官能团的鉴别化合物真伪的鉴别羟基（酚羟基、醇羟基）3600~3200cm-1

游离羟基~3600cm-1

氢键缔合羟基3400~3200cm-1

羰基1600~1800cm-1酮~1710cm-1酯1710~1735cm-1芳环1600、1580、1500cm-1有2~3个峰双键1620~1680cm-1两个化合物完全相同的条件1、特征区完全吻合2、指纹区也需完全一致1H-NMR（核磁共振氢谱）:信息参数：化学位移（δ）、峰面积、峰裂分（s、d、t、q、m）及偶合常数（Ј）（1）化学位移（δppm）:与1H核所处的化学环境（1H核周围的电子云密度）有关电子云密度大，处于高场，δ值小电子云密度小，处于高场，δ值大~0.9-C-CH3

~1.8-C=C-CH3~2.1-COCH3

~3.0-NCH3

~3.7-OCH3

11109876543210-COOH-CHOAr-H-C=C-H常见结构的化学位移大致范围（要求熟记）(δ(δppm)

推断化合物的结构（含1H核基团的结构）

（二）峰面积:磁等同质子的数目——用积分曲线面积（高度）表示

（三）峰裂分及偶和常数:磁不等同两个或两组1H核在一定距离内相互自旋偶合干扰，发生的分裂所表现出的不同裂分符合n+1规律(n=磁等同质子的数目)用偶合常数（J）表示峰裂分的数目峰裂分的距离不同系统偶合常数(JHz)大小s单峰d双峰t三重峰q四重峰m多重峰芳环J邻6~10HzJ间0~3HzJ对0~1Hz双键J顺7~11HzJ反12~18Hz饱和烃类相邻碳原子上质子偶合常数的大小与两个氢原子之间的立体夹角θ有关θ=60OJ=2~4Hzθ=180OJ=9~10Hz环己烷及其类似物相邻碳原子上质子的偶合常数Jaa10~13Hz(θ=180O)Jae2~5Hz(θ=60O)Jee2~5Hz(θ=60O)1H-NMR核磁共振辅助技术：（1）重氢(D2O)交换——推断活泼质子（羟基）的存在与否（2）核增益效应（NOE）：指在核磁共振中选择性照射一种质子使其饱和，则与该质子在立体空间位置上接近的另一或数个质子信号强度增高的现象。（3）溶剂位移：苯诱导位移——由于溶剂分子（苯）的接近，对化合物将发生不同的屏蔽及去屏蔽作用，使质子化学位移发生变化的现象。13C-NMR（核磁共振碳谱）：FT-NMR:即脉冲傅里叶变换核磁共振。其装置原理为采用强的脉冲照射使分子中所有的13C核同时发生共振，生成在驰豫期内表现为指数形式衰减的正弦波信号（自由诱导衰减；FID），再经傅里叶变换即成为正常的NMR信号。随着脉冲扫描次数的增加及计算机的累加计算，13C信号将不断得到增强，噪音则越来越弱。经过若干次的扫描及累加计算，最后即得到一张好的NMR谱。由于该装置的出现及计算机的引入，才使得13C-NMR用于有机化合物结构研究成为可能。信息参数：化学位移（δC）、异核偶合常数（JCH）、驰豫时间（T1）(1)化学位移：大致范围(δC）0~200ppm不同13C核δC大小与13C核所处的化学环境（周围电子云密度）有关

用于13C核类型的推断

(δCppm)

150~220(c=o)

200150100500

c=cAr

50~80(c-o)

饱和碳原子（0~60）

主要结构13C核δC的大致范围(要求熟记)

常用13C-NMR测定技术及其特征：

(1)质子宽带去偶（BBO）:也叫全氢去偶（COM）.噪音去偶.采用宽频电磁辐射照射所有1H核使之饱和后测得的13C-NMR谱（即去掉所有氢核对碳核的偶合影响）。特征：图谱简化，每个碳原子都为单峰，互不重叠。方便于判断碳信号的化学位移。伯、仲、叔碳峰增强，季碳为弱峰（照射1H核产生NOE效应）无法区别碳上连接的1H核数目。（2）偏共振去偶：（此法现已基本上被DEPT所替代）仅保留直接与碳原子相连1H核对碳的偶合J1CH（即去掉氢核对碳核的远程偶合J2CHJ3CH）伯（-CH3)表现为四重峰（q）仲（-CH2-)三重峰(t)叔（-CH-)双峰(d)季（-C-）单峰(s)碳核（伯、仲、叔、季）类型的判断（3）DEPT(无畸变极化转移增强法)：（为13C-NMR谱的一种常规测定方法）系通过改变照射1H核的脉冲宽度（或设定不同的驰豫时间）使不同类型13C信号在谱图上呈单峰，并分别呈现正向峰或倒置峰脉冲宽度峰的特征Θ=450CH3↑CH2↑CH↑(↑代表正向峰)Θ=900CH↑Θ=1350CH3↑CH↑CH2↓（↓代表倒置峰）可用于区别伯（CH3）、仲（CH2）、叔（CH）碳信号与质子宽带去偶谱比较，还可以确定季碳（-C-）信号二维核磁共振谱（2D-NMR谱）

质谱（MS）:1．确定分子量（高分辨质谱可将分子量精确到小数点后三位）,计算分子式。2．提供其他结构信息。如黄酮类，依碎片离子峰可以确定A-环,B-环的取代模式。3．与标准图谱比较用于化合物的鉴别（相同条件下，其裂解是符合一定规律的）。4．依裂解特征