标准解读

《GB/T 22917-2008 猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法》是一项国家标准，旨在规范猪水泡病病毒（SVDV）的检测流程。该标准详细描述了使用荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术对猪水泡病病毒进行定性检测的方法。以下是对该标准主要内容的说明：

首先，标准明确了实验所需的主要仪器设备和试剂，包括但不限于实时荧光定量PCR仪、微量离心机、核酸提取试剂盒等，并且强调了实验室应具备的基本条件以确保检测结果准确可靠。

接着，对于样品处理部分，给出了具体的采样部位建议如口腔拭子、皮肤病变处等，并提供了详细的样本保存与运输指南，确保样本质量不受影响。

在RNA提取环节，推荐采用商业化的RNA提取试剂盒，并按照说明书操作完成总RNA的抽提过程。此外，还特别指出了防止RNA降解的重要性以及采取相应措施的方法。

随后是cDNA合成步骤，利用随机引物或特异性引物将提取得到的RNA反转录为互补DNA(cDNA)。此过程中需严格控制反应体系及温度条件，以保证cDNA的有效生成。

核心部分即荧光RT-PCR扩增阶段，标准中列出了针对SVDV特定区域设计的引物序列及其探针信息，同时规定了最佳退火温度、循环数等参数设置。通过比较目标基因片段与内参基因的Ct值差异来判断样本是否含有猪水泡病病毒。

最后，在结果分析方面，《GB/T 22917-2008》提出了一套基于阈值法判定阳性与否的标准，并要求每个批次都设立阴性对照、阳性对照以及无模板对照以验证整个检测系统的有效性。

以上内容涵盖了从样本采集到最终报告出具的全过程指导，为实验室开展猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测提供了科学依据和技术支持。


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  • 2008-12-31 颁布
  • 2009-05-01 实施
©正版授权
GB/T 22917-2008猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法_第1页
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文档简介

犐犆犛１１．２２０

犅４１

中华人民共和国国家标准

犌犅／犜２２９１７—２００８

猪水泡病病毒荧光犚犜犘犆犚检测方法

犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳犳犾狌狅狉狅犵犲狀犻犮犚犜犘犆犚犳狅狉狊狑犻狀犲狏犲狊犻犮狌犾犪狉犱犻狊犲犪狊犲狏犻狉狌狊

２００８１２３１发布２００９０５０１实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

书

犌犅／犜２２９１７—２００８

前言

本标准参考了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》

（第５版）。

本标准的附录Ａ为规范性附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检

疫局。

本标准主要起草人：花群义、卢体康、吕建强、阮周曦、杨云庆、周晓黎、杨素、董俊、陈书琨。

Ⅰ

书

犌犅／犜２２９１７—２００８

猪水泡病病毒荧光犚犜犘犆犚检测方法

１范围

本标准规定了猪水泡病病毒荧光ＲＴＰＣＲ检测的操作方法。

本标准适用于动物及其产品中猪水泡病病毒的检测。

２缩略语

下列缩略语适用于本标准。

２．１荧光犚犜犘犆犚

荧光反转录聚合酶链反应。

２．２犆狋值

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

２．３犚犖犃

核糖核酸。

２．４犇犈犘犆

焦碳酸磷酯。

２．５犘犅犛

磷酸盐缓冲盐水，配方见附录Ａ。

２．６犜犪狇酶

犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。

２．７犛犞犇犞

猪水泡病病毒。

３原理

根据猪水泡病病毒的基因特定序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。引物

和探针通过严格的设计和筛选，涵盖已报道的所有猪水泡病病毒的毒株。荧光探针的５′端标记ＦＡＭ

荧光素，３′端标记ＴＡＭＲＡ荧光素，它在近距离内能吸收５′端报告荧光基团发出的荧光信号。扩增时，

由于犜犪狇酶的５′→３′的外切活性，在延伸到荧光探针时，将其切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信

号产生。因此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。

４材料与试剂

４．１仪器与器材

４．１．１荧光ＲＴＰＣＲ检测仪。

４．１．２高速台式冷冻离心机（离心速度１２０００ｒ／ｍｉｎ以上）。

４．１．３台式离心机或手掌式离心机（离心速度３０００ｒ／ｍｉｎ）。

４．１．４混匀器。

４．１．５冰箱（２℃～８℃和－２０℃两种）。

４．１．６微量可调移液器（５μＬ，１０μＬ，１００μＬ，１０００μＬ）及配套带滤芯吸头。

４．１．７１．５ｍＬ、０．５ｍＬ硅化Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管：将Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管和滴头浸泡于含有０．１％

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