选修课基因治疗

基因诊断与基因治疗基因诊断2023/2/5232023/2/5第一节基因诊断的基本概念第二节基因诊断的基本方式和方法第三节基因诊断的应用42023/2/5第一节基因诊断的基本概念一、分子诊断与基因诊断二、基因诊断的基本流程52023/2/5分子诊断一、分子诊断与基因诊断

用分子生物学技术对生物体的DNA序列及其产物（RNA和蛋白质）进行定性、定量分析，为疾病诊断提供依据（moleculardiagnosis）62023/2/5基因诊断定义（genediagnosis）

针对DNA和/或mRNA的分子诊断，通过分析这些遗传信息分子的序列，从而在分子水平上确定疾病的病因，具高度特异性基因诊断的前提已明确疾病表型与基因型的关系72023/2/5基因诊断的内容检测个体的基因序列的特征基因突变分析测定基因的拷贝数基因表达产物分析检测是否存在外源基因82023/2/5基因诊断的基本技术流程92023/2/5第二节基因诊断的基本方式和方法一、对疾病相关遗传标志的连锁分析二、对疾病致病基因结构异常的直接诊断102023/2/5一、对疾病相关遗传标志的连锁分析连锁分析（linkageanalysis）利用与致病基因相连的某些基因，作为遗传标志，通过鉴定遗传标志的存在而判断个体是否带有致病基因优点

无需更多了解致病基因结构及其分子机制缺点

没有直接检测致病基因突变，是间接诊断112023/2/51.连锁分析的遗传标志特点●不同个体之间存在高度的多态性

●需要获得足够数量的家系成员样本

●标记基因与致病基因相连锁122023/2/5连锁遗传标志的类型单核苷酸变异短串联重复序列变异

目前可用于基因诊断的连锁遗传标志主要包括两种形式的DNA变异132023/2/5

在人类基因组中，大约平均200～500bp就可发生一次变异。这些变异使个体之间广泛存在着DNA单核苷酸序列的差异单核苷酸变异142023/2/5可检测的单核苷酸变异的遗传标志限制性片段长度多态性

（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）

152023/2/5限制性片段长度的多态性指DNA序列上发生一个变异后获得或丢失了一限制性识别位点，使DNA限制性片段长度发生变化，在人群中形成两种或两种以上的限制性类型利用特定限制性识别位点进行基因分析单核苷酸变异162023/2/5单核苷酸多态性

（singlenucleotidepolymorphism，SNP）

指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最少的一种在群体中的频率不小于1%SNP可以确定个体的疾病易感性和药物反应性单核苷酸变异172023/2/5短串联重复序列串联重复序列基因组中某种核心序列彼此连接重复排列而成的特殊序列短串联重复序列（shorttandemrepeat，STR）

在串联重复序列中的一种2～4bp的重复单位182023/2/5●在人类基因组中分布广泛，总数大约有5～10万个●个体之间的STR都是互不相同的●能够稳定地遗传短串联重复序列的结构特点192023/2/52.连锁分析的主要方法

RFLP连锁分析

基于STR的微卫星分析

基于SNP的单倍型分析202023/2/5二、对疾病致病基因结构异常的直接诊断1.基因缺失或插入的诊断2.点突变的诊断3.STR序列的诊断212023/2/5Southern印迹法跨越断裂点的PCR（又称裂口PCR，gap-PCR）1.基因缺失或插入的诊断222023/2/52.点突变的诊断等位基因特异性寡核苷酸分子杂交

（allelespecificoligonucleotide，ASO）

反向点杂交

（reversedotblot，RDB）变性高效液相色谱（denaturehighperformanceliquidchromatography，DHPLC）

被测点突变的确切位置及其基因序列已经清楚前提条件主要方法232023/2/5反向点杂交（reversedotblot，RDB）

将针对各种突变和正常序列的ASO探针固定在杂交膜上，而将原来在ASO杂交体系中固定在膜上的PCR产物改为液相进行杂交，这种方法称为RDB。是改进的ASO技术

242023/2/5变性高效液相色谱

利用PCR扩增过程的单链DNA产物可以随机与互补链相结合而形成双链的特性，依据最终产物中是否会出现异源双链来判断待测样品中是否存在点突变252023/2/53.STR序列的诊断

可用PCR直接扩增技术来诊断基于STR的DNA片段长度多态性STR:短串联重复序列262023/2/5第三节基因诊断的应用一、辅助遗传病的临床诊断二、疾病易感性及患病风险预测三、疗效评价及用药指导四、其他应用272023/2/5一、辅助遗传病的临床诊断我国前能开展的基因诊断

单基因遗传病的基因诊断以淘汰重型患儿为目的的产前诊断

282023/2/5二、疾病易感性及患病风险预测1.遗传病患病风险分析2.其他疾病易感性预测性诊断292023/2/51.遗传病患病风险分析产前诊断植入前遗传学诊断遗传筛查302023/2/5产前诊断

分析胎儿的某些特定基因以诊断人类染色体病和单基因遗传病312023/2/5

指对配子或移入宫腔之前的胚胎进行快速的遗传学分析，筛选出健康配子或胚胎，以避免异常妊娠的一项技术植入前遗传学诊断322023/2/5遗传筛查

指针对特定人群的系统检查，以期获得被检测群体中的个体是否拥有某一特定疾病的基因型，从而为被检对象或其子女提供疾病易感性、患病风险的相关信息332023/2/52.其他疾病易感性预测性诊断肿瘤与癌基因抑癌基因

在一些有明显遗传倾向的肿瘤中，这二类基因的突变与肿瘤发生有密切关系例：

视网膜母细胞瘤与RB基因

Li-Fraumeni综合征与p53基因乳腺癌与BRCA-1基因对这些基因的突变分析对于疾病诊断和预测肿瘤发生风险有一定的参考价值342023/2/5三、疗效评价及用药指导

遗传诊断可应用于临床药物疗效的评价及提供指导用药的信息352023/2/5四、其他应用1.法医学2.病原体的基因诊断362023/2/5

1.法医学DNA指纹鉴定技术遗传学基础是DNA的多态性DNA指纹图谱分析372023/2/52.病原体的基因诊断

针对病原体自身特异性核酸（DNA或RNA）序列进行的诊断分子杂交基因扩增方法优点应用范围广泛简便快速、成本低特异、敏感、便于定量基因治疗2023/2/538基因治疗

概念基因治疗：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。基因疗法是指将外源正常基因导入靶细胞，通过替代异常基因、封闭致病基因、剪去致病基因、修复受损基因和重建基因调控系统等，以纠正或补偿因基因缺陷和异常所引起的疾病，从而达到治疗的目的

全世界已获准的基因治疗临床试验方案达一千多项，其中，66%是针对癌症的治疗二、基因治疗的必要条件发病机制在DNA水平上已经清楚要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作三.基因治疗方式直接基因治疗和间接基因治疗直接基因治疗(致病基因的原位置换)：纠正突变基因

在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）基因敲出技术（geneknockout)

是指通过基因同源重组的过程定向的在活细胞中从基因组上移出特定基因的过程，从而建立基因剔除细胞和基因剔除生物

2、间接基因治疗：

导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。而对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。直接抑制有害基因的表达基因增补：将目的基因导入病变细胞，并在细胞内表达，不需将缺陷基因替换出来，只要目的基因在细胞中能够表达，就达到了治疗的目的。这是目前基因治疗大多采用的方法，对单拷贝基因遗传病有效。如血友病。基因干预(geneinterference)：指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。基因干预基因干预的种类：反义RNA：封闭基因表达核酶：裂解特异的靶mRNARNA干涉技术：

反义RNA(antisenseRNA):是指与mRNA互补的RNA分子,通常由15-20个核苷酸组成。这种反义RNA能与mRNA分子特异性地互补结合形成二聚体,从而阻止靶核酸的表达。两种机制:1.反义寡聚核苷酸可以激活RNaseH，该酶可以切割DNA·RNA杂合分子中的RNA链，导致靶mRNA降解2.反义寡聚核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶mRNA的翻译靶RNA上的结合位点必须是暴露的反义试剂必须被保护起来免遭核酸酶攻击必须保证反义试剂能够被细胞摄取并在胞内正确定位需克服技术问题:

2001，2002连续两年被美国《Science》杂志评选为年度10大突破技术RNA干涉RNA干涉（RNAinterference，RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。

2006年10月2日，现年47岁的AndrewZ.Fire和45岁的CraigC.Mello由于在基因沉默现象研究领域的杰出贡献而获得诺贝尔医学奖。

RNA干涉机制:螺旋酶、RNA依赖的RNA聚合酶）,可以切割双链RNA，双链RNA再与Dicer形成沉默复合物(RISC)，RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干涉的过程。

2个步骤：（1）长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的核酸酶(Dicer)切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（smallinterferingRNA）（2）小干扰性RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），该复合体可识别与小干扰性RNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断

目前RNA干扰技术主要应用于探查基因功能和探索治疗肿瘤或感染性疾病的可能性.初步的实验结果提示RNA干扰技术可用于治疗有异常基因的人肿瘤。用RNA干扰技术可以阻碍K-RAS蛋白的表达从而抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1的人白血病细胞系。通过RNA干扰抑制某些内源性基因的表达能促进白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。

将RNA干扰技术用于临床治疗人类疾病还有许多研究工作要做，如何将小干扰性RNA或能在细胞内生成小干扰性RNA样转录物的质粒DNA或病毒载体安全、有效地导入靶组织或靶细胞就是一个必须解决的问题。RNA干扰技术用于治疗人类疾病的安全性仍是个未知数。四、基因治疗的基本程序

目的基因的选择与获得载体的选择将目的基因克隆到载体基因表达的检测治疗效果的体外研究建立动物模型治疗效果的体内研究药代及药理毒理研究中试研究申报及进行临床试验扩大规模进行试生产(一)、目的基因的选择：1.能改变肿瘤细胞的恶性表型的基因

肿瘤细胞主要有癌基因的突变、扩增、过度表达，对此可采用反义核酸或核酶；抑癌基因的突变、失活等，可采用野生型的正常基因作为治疗基因，用正常基因剔除或替换缺陷基因。

2.能提高肿瘤细胞的免疫原性的基因

向肿瘤细胞转导参与细胞免疫的细胞因子（如IL-2、GM-CSF）基因，共刺激分子B7基因等，以增强宿主的抗癌免疫反应，可统称为免疫基因治疗。

3.肿瘤药物增敏基因

肿瘤药物敏感基因治疗是将编码某一敏感性因子的基因转入肿瘤细胞，使肿瘤细胞对某种原本无毒或低毒的药物产生特异的敏感性而死亡。这一表达敏感性因子的基因也被称为自杀基因.常用的自杀基因有单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因

,该基因能将无细胞毒性的原药丙氧鸟苷（GCV）磷酸化，对细胞产生毒性作用理想的治疗基因还必须：基因可有效导入靶细胞基因能在靶细胞中长期稳定存留导入基因能适量表达导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害(二)基因载体的选择

有病毒载体有非病毒体两类，多用病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。常用病毒载体的比较

逆转录病毒载体腺病毒载体腺相关病毒载体载体大小8.5kb36kb(大)5kb(小)核酸类型RNADNADNA外源基因容量＜7kb2～7kb＜3.5kb(小)靶细胞要求分裂细胞；

表面须有特殊受体分裂或非分裂细胞分裂或非分裂细胞基因整合随机整合不整合定点整合于19号染色体长臂外源基因表达情况瞬时表达/稳定表达瞬时表达稳定表达基因转染效率高高不明(三)选择基因治疗的靶细胞体细胞：目前基因治疗的现状仅限于体细胞。基因型的改变只限于患者本人，不会遗传到下代。生殖细胞：理论上这是基因治疗的重点，对生殖细胞中缺陷基因的纠正，不仅使患者本人（当代）的缺陷得以更正，而且能将正常基因遗传到下代，是一种彻底根治缺陷的方法。但是由于风险大，问题复杂，至今仍未有人敢实验。1、发病的器官及位置2、容易取出和植入3、容易在体外培养4、容易被转导5、寿命较长基因治疗中体细胞的选择免疫细胞

外周血淋巴细胞是恶性肿瘤、获得性及遗传性免疫系统紊乱性徉病的基因治疗的主要靶细胞。主要以T淋巴细胞为主成纤维细胞

成纤维细胞位于全身并具有较强的自我更新能力。优点有：①易于获得；②容易体外培养和扩增；③分裂中的成纤维细胞易与逆转录病毒一起稳定转导，并能较稳定的表达外源目的基因；④携带外源基因后能稳定地回植体内并进行表达；⑤回植的成纤维细胞容易取出，等。主要缺点是在体内由于细胞凋亡而引起的基因表达失活。骨骼肌细胞

易于获得及在体个可大量扩增，可用于治疗累及肌肉的遗传病及一旦插入分泌性基因可使基因产物直接分泌进入血液等。

血管平滑肌细胞

血管平滑肌细胞易于获得、培养和移植，故是基因治疗常用的靶细胞。造血干细胞

造血干细胞是基因治疗遗传病、自身免疫性疾病及癌症常用的靶细胞。在肿瘤基因治疗中，造血干细胞是耐药基因、细胞因子基因等较理想的受体细胞。

(四)基因转移应用物理、化学或生物学等技术和方法将外源目的基因（可以是基因的DNA片段或序列）转移到受体菌或者细胞内，并在细菌或细胞内实现转入基因的扩增和表达，称为基因转移技术。1、非病毒导入法：直接注射法、电穿孔法、脂质体法、阳离子多聚体2、病毒载体导入法遗传病的基因治疗研究1990.9.14首例基因治疗4岁女孩