第7-13章高效液相部分-色谱应用技术

LOGOHPLC应用与操作技术药物分析教研室郑枫

样品的性质和分离目的HPLC方法建立的步骤样品前处理方法的选择检测器的选择选择、优化色谱分离条件定量分析定性分析纯化物质方法学确证常规样品：色谱柱：正相、反相流动相：改变流动相组成：离子抑制、离子对

改变流动相洗脱方式：等度、梯度洗脱

样品：衍生化对映异构体：手性高效液相色谱HPLC条件的选择《PracticalHPLCMethodDevelopment》L.RSnyder，J.J.Kirkland《实用高效液相色谱方法建立》

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一、药物衍生化的目的减小前处理难度或增加稳定性；123改善色谱分离；提高检测性能；改善色谱分离。有利于复杂样品的衍生化分析。柱前衍生化柱后衍生化复杂样品衍生化难度大。不改善色谱分离，反而可能造成峰展宽。特点限制二、衍生化方式1324反应定量迅速易于分离检测反应选择性高方便，通用性好三、衍生化反应的要求氨基酸的紫外衍生化试剂+异硫氰酸苯酯茚三酮+紫外衍生化反应荧光衍生化反应衍生化试剂的基本结构示意图磺酰氯类试剂胺类和氨基酸的荧光衍生化试剂+丹酰氯，DNS-Cl激发波长：350-370nm发射波长：490-540nm含有羰基的试剂胺类和氨基酸的荧光衍生化试剂邻苯二甲醛（OPA）

+特点：本身无荧光，产物有荧光；反应迅速，适合柱后衍生化。激发波长：340nm发射波长：455nm福多斯坦衍生化示例福多司坦半胱氨酸+++氨基酸常用衍生化试剂的比较衍生化试剂优点缺点邻苯二甲醛（OPA）反应迅速；可检测形式多；试剂不发荧光。不能与二级氨基酸直接反应；衍生物不稳定。异硫氰酸酯（PITC）与一、二级氨基酸都可以反应；稳定，衍生副产物对测定无干扰；紫外检测。需除去衍生试剂；样品制备需较长时间；PITC毒性大；灵敏度较低丹酰氯（DNSCl）反应迅速；可检测形式多；剩余衍生试剂不需除去；可与二级氨基酸反应；衍生物较稳定。DNSCl水解产物也可发射强荧光，干扰测定；反应要在避光条件下进行；专属性差定量限：300ng/ml质谱衍生化反应增加色谱保留定量限：50ng/ml福多司坦测定方法的比较方法一方法二方法三方法四固定相

C18C18C18NH2流动相乙腈-水(含0.02M戊烷磺酸钠）乙腈-水甲醇-水甲醇-水检测器紫外（210nm）直接测定荧光（FD）柱前衍生化质谱（MS）柱前衍生化串联质谱（MS-MS）直接测定定量限10μg/mL300ng/ml50ng/ml10ng/ml文献中国新药杂志2004药学学报2005J.MassSpectrom.2006尚未发表分离：色谱柱：正相、反相流动相：改变流动相组成：离子对

检测：换用灵敏度更高的检测器衍生化：同时改善分离和检测

HPLC条件的选择羰基化合物的荧光衍生化试剂丹酰肼（DNSH）+羧酸的荧光衍生化试剂香豆素类试剂+4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（BrMMC）激发波长：325nm发射波长：400nm电化学衍生化标记反应还原衍生试剂电化学衍生化标记反应氧化衍生试剂衍生化反应选择策略1.根据分析要求（基质复杂性、灵敏度等）选择衍生化反应类别；灵敏度：质谱>荧光>紫外2.根据被分析物结构特点选择相应类别的衍生物试剂；3.进一步优化测定条件，进行方法学验证。梯度洗脱技术（gradientelution）

等度定义：色谱分离过程中，流动相中有机相比例或离子强度、pH值不断改变的洗脱方式。目的：适用于保留范围宽的多组分复杂样品。梯度流动相洗脱方式isocraticelution梯度洗脱的应用特点（1）解决组分k值差距过大对分离带来的困难；（2）解决组分在色谱柱上残留问题；（3）进样量体积较大时产生峰展宽方式：在开始一段时间内，使用洗脱能力较弱的流动相，随着流动相洗脱强度增加，色谱保留较强的组分较快被洗脱，缩短分析时间。

（4）改善峰型常见洗脱方式应用最多的是有机相比例随着分离时间不断发生变化，洗脱类型：方式选择预实验梯度范围调整分离度1234梯度洗脱判断各组分保留性质确定是否需要梯度确定流动相起始和最终比例改变流动相比例变化速率混合物分离的梯度洗脱方法建立步骤时间（min）20%甲醇（0.5%甲酸）80%甲醇（0.5%甲酸）010001.0001004.0001004.0110006.001000梯度洗脱的不足（1）方法建立更为复杂、困难；（