引物软件课件

引物软件课件第一页，共七十五页，2022年，8月28日PCR原理概述PCR技术又称聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction）技术，是一种在体外（试管、切片…）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。

PCR原理第二页，共七十五页，2022年，8月28日引物设计原则

引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补；

其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；

再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。第三页，共七十五页，2022年，8月28日

引物设计应注意如下要点：

引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。∆G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G值相对较高的引物。引物的3’端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。第四页，共七十五页，2022年，8月28日DNA/mRNA引物的区别DNAintronexonmRNAAAAAAA3’5’pmGpppG第五页，共七十五页，2022年，8月28日软件设计引物

软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以Oligo6最优秀。其次是引物的自动搜索功能，以PrimerPremier最强且方便使用，Oligo6其次。因此，要得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。以PrimerPremier进行自动搜索，Oligo进行分析评价，可快速设计出成功率很高的引物。第六页，共七十五页，2022年，8月28日PRIMERPREMIER5.0使用说明第七页，共七十五页，2022年，8月28日1、PRIMERPREMIER5.0简介第八页，共七十五页，2022年，8月28日是由加拿大Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计和评估的软件。其主要界面分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（PrimerDesign），酶切分析窗口（RestrictionSites）和Motif分析窗口。第九页，共七十五页，2022年，8月28日第十页，共七十五页，2022年，8月28日第十一页，共七十五页，2022年，8月28日第十二页，共七十五页，2022年，8月28日第十三页，共七十五页，2022年，8月28日第十四页，共七十五页，2022年，8月28日第十五页，共七十五页，2022年，8月28日第十六页，共七十五页，2022年，8月28日第十七页，共七十五页，2022年，8月28日第十八页，共七十五页，2022年，8月28日第十九页，共七十五页，2022年，8月28日第二十页，共七十五页，2022年，8月28日第二十一页，共七十五页，2022年，8月28日第二十二页，共七十五页，2022年，8月28日第二十三页，共七十五页，2022年，8月28日第二十四页，共七十五页，2022年，8月28日第二十五页，共七十五页，2022年，8月28日第二十六页，共七十五页，2022年，8月28日第二十七页，共七十五页，2022年，8月28日第二十八页，共七十五页，2022年，8月28日File菜单中的Parameter命令可以对系统参数，PCR反应条件和程序打分系统进行设置，以帮助用户根据自己的特殊要求来进行引物设计，其中反应条件按照引物浓度，单价离子浓度，Mg离子浓度，Na盐浓度等。而打分系统是参照的以下公式：根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。第二十九页，共七十五页，2022年，8月28日第三十页，共七十五页，2022年，8月28日第三十一页，共七十五页，2022年，8月28日引物设计（PrimerDesign），酶切分析（RestrictionSites）和基序分析（Motif）

第三十二页，共七十五页，2022年，8月28日当一个基因被识别、其DNA序列被解读时，人们往往仍然无法弄清相应的蛋白序列是什么。这是因为在没有其它信息的前提下，DNA序列可以按六种框架阅读和翻译（每条链三种，对应三种不同的起始密码子）。阅读框的次序（+1,+2,+3,-1,-2,-3)。第三十三页，共七十五页，2022年，8月28日

2、实例分析：VEGFA的引物设计第三十四页，共七十五页，2022年，8月28日

2.1确定目的基因序列（1）第三十五页，共七十五页，2022年，8月28日第三十六页，共七十五页，2022年，8月28日第三十七页，共七十五页，2022年，8月28日第三十八页，共七十五页，2022年，8月28日第三十九页，共七十五页，2022年，8月28日基因特点描述第四十页，共七十五页，2022年，8月28日第四十一页，共七十五页，2022年，8月28日第四十二页，共七十五页，2022年，8月28日第四十三页，共七十五页，2022年，8月28日第四十四页，共七十五页，2022年，8月28日

（2）查找人VEGFA基因的第4个外显子的序列

事实上，在NCBI有很多种办法可以确定某个基因的外显子或者内含子，当然还有UTR区域。通过Blast是一种办法，但不够直观，需要判断的条件要多一些，经验也需要多一些。如果条件允许的话，我们可以借助其它一些专门的软件,让事情变得容易。今天我们来介绍NCBI的其中一个软件，SplignSplign-isautilityforcomputingcDNA-to-GenomicalignmentsbasedonavariationoftheNeedleman-WunschalgorithmcombinedwithBlastforcompartmentdetectionandgreaterperformance.Splign-通过mRNA或EST序列与所在的基因组序列比对，用于单个基因结构图（外显子内含子）显示,用户每次只能提交一个基因序列。

第四十五页，共七十五页，2022年，8月28日GeneID基因名会随着版本的升级而变化，当然，以前使用过的基因名也会保留。但该基因只对应一个GeneID，无论基因名如何改变，GeneID是唯一的。这个ID是非常重要的。第四十六页，共七十五页，2022年，8月28日第四十七页，共七十五页，2022年，8月28日在RefSeq区域，我们将可以看到这个基因的参考序列，有mRNA和基因组的。这个区域不一定每个基因都有。NM_开头的序列都是参考序列。第四十八页，共七十五页，2022年，8月28日输入序列的accession或者是全部序列以FASTA的格式填入所要比对的基因的全序列或者是accession.所提交的基因组序列长不要超过75000000bp网址：（点击online，在线运行）第四十九页，共七十五页，2022年，8月28日第五十页，共七十五页，2022年，8月28日鼠标放在这里，会显示该区域的序列长度，VEGFA外显子4的长度为77bp这里看得出来，有8个外显子外显子数，点击可以直接查看序列结果一目了然，8个外显子，而且还显示mRNA以及对应的基因组比对的序列，并且还可以知道某个外显子在mRNA序列上的区域。就连UTR区的序列也知道了第五十一页，共七十五页，2022年，8月28日第五十二页，共七十五页，2022年，8月28日第五十三页，共七十五页，2022年，8月28日第五十四页，共七十五页，2022年，8月28日最上面一层左面是5个控制按钮，用于实现引物设计中的各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑显示模板和引物序列及二者间的配对情况的显示

显示两个引物的各种参数，包括给引物的打分，引物以及产物的起始位置、长度、Tm值、GC％、简并性有关于引物的二聚体结构、发卡结构、错配情况和引物间二聚体结构的预测显示的是对PCR扩增有影响的结构的位置，结构细节和稳定能第五十五页，共七十五页，2022年，8月28日根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定搜索引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。第五十六页，共七十五页，2022年，8月28日GC夹第五十七页，共七十五页，2022年，8月28日第五十八页，共七十五页，2022年，8月28日第五十九页，共七十五页，2022年，8月28日在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物搜寻界面中相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能存在的不利结构。第六十页，共七十五页，2022年，8月28日利用引物编辑窗口对程序自动找到的或手工找到的引物序列进行编辑，以便用户能在引物引入突变及加入特定的酶切位点，并对修改后的序列的二聚体结构、发卡结构和错配进一步评估。

第六十一页，共七十五页，2022年，8月28日除了以上的直观地对引物进行基本的设计和评估功能外，该程序还提供了多种数据报告，主要通过Report菜单和Graph菜单中命令来实现。第六十二页，共七十五页，2022年，8月28日△G是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。引物的3’端△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。第六十三页，共七十五页，2022年，8月28日引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓而使PCR反应不能正常进行。第六十四页，共七十五页，2022年，8月28日首先进行了引物自动搜索后，即可通过Function菜单中Multiplex/NestedPrimer命令进入巢式PCR引物设计，通过点中代表各个引物的三角号来选择引物，然后根据最下面的窗口中各个引物之间的二聚体形成情况来判断引物是否适合于作为巢式PCR的引物。第六十五页，共七十五页，2022年，8月28日

总的来说，Primer设计引物的经验为：1、引物取分值高的；2、两个引物的Tm值比较接近为好，温度为五六十度，不要高于七十度；3、引物之间的距离200-1000比较常见；4、Tm减去5度为退火温度；5、引物和产物的Tm值不要相差太大，20摄氏度范围内较好。6、最好能跨内含子，因为这样可以与基因组的序列分开来（适用于RT-PCR）第六十六页，共七十五页，2022年，8月28日

简并引物的设计第六十七页，共七十五页，2022年，8月28日

利用primerpremier5设计简并引物

（1）选择高度保守的序列来设计引物。如果可能的话，选择在基因家族内和不同种属间都保守的序列。（2）将参与多序列比对的序列中的任一条导入prime